导读:本文包含了纤维堆囊菌论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:纤维,霉素,聚糖,酪氨酸,丙酮酸,磷酸酶,激酶。
纤维堆囊菌论文文献综述
孙宝婷,祝文兴,刘新利[1]（2017）在《纤维堆囊菌So ce2161限制修饰系统研究》一文中研究指出采用双向电泳技术从So ce2161中未获得内源性质粒,通过对So ce2161培养液、细胞壁及菌体内部DNA核酸酶进行提取纯化,并与外源基因孵育,发现了有较强活性的DNA核酸酶,对DH5α基因组DNA、质粒pET-32a均有降解作用。(本文来源于《齐鲁工业大学学报(自然科学版)》期刊2017年03期）
孙宝婷[2]（2017）在《纤维堆囊菌优选菌株Soce157-2限制性遗传屏障的研究》一文中研究指出粘细菌按照其利用底物类型的差异,分为嗜细菌群和嗜纤维素群两大类,在嗜纤维素群中,纤维堆囊菌属是目前唯一可以分解纤维素的菌属。目前,纤维堆囊菌通过优化发酵技术的途径提高埃博霉素产量的研究已达到瓶颈,因此,利用合成分子机制提高次级代谢产物产量是目前纤维堆囊菌研究的重点,而建立高效的遗传操作体系是纤维堆囊菌研究的基础。此外,在粘细菌类群中,同一种属的不同菌株之间,其遗传操作同样也难以通用。本文应用的纤维堆囊菌Soce157-2,在菌体中尚未发现内源性质粒,因此,应用于纤维堆囊菌遗传操作的载体,需借助外源质粒来实现,其操作难度大且效率较低,而且纤维堆囊菌对大部分的抗生素都有抗性,所以,遗传标记的筛选范围较窄,限制了其分子水平研究的进展。上述基本状况是纤维堆囊菌遗传操作困难原因的一方面,另一方面是由于限制修饰系统的存在,明显阻碍或减少了外源DNA的进入。外源DNA由于没有被修饰过,一旦进入细菌内就会被降解,很大程度上影响了该菌遗传操作的成功率。基于上述分析,本文将在以下方面进行研究:1.对实验室所用菌株纤维堆囊菌So ce157-2进行了系统的生理生化反应和32种抗生素抗性的分析,为纤维堆囊菌的遗传操作和限制修饰系统的探究提供了可靠的生理生化基础,通过实验结果的分析和对前人实验的综合考虑,选用了氯霉素作为筛选标记。由于纤维堆囊菌不同于其他细菌,代时长,生长缓慢,极易染菌,因此,本文通过一系列单因素和正交实验对纤维堆囊菌So ce157-2生长条件进行了优化,得到最佳实验条件为:装液量60 mL/250mL,在温度32℃、初始pH9.0、接种量6%、生长时间72 h、种龄60 h条件下,纤维堆囊菌So ce157-2培养活性最佳。2.纤维堆囊菌的G+C含量高,载体自身的启动子元件由于G+C含量低于So ce157-2的G+C含量,无法正常表达氯霉素抗性,因此选用aphII作为启动子。经PCR扩增获得aphII启动子片段和氯霉素乙酰转移酶基因片段,将其连接后导入自杀质粒pCVD442中,构建pCVD442-cat载体,将从So ce157-2的基因组中PCR得到的叁段不同大小的片段分别导入pCVD442-cat载体中,获得pCVD442-cat-1、pCVD442-cat-2、pCVD442-cat-3叁种质粒,通过接合转移的方法从双质粒大肠杆菌中转移至So157-2中,阳性率达到了100%,建立了遗传操作系统。通过pH值及热击对接合转移效率影响的摸索,确定pH值为8.5至9.0时,接合转移效率最高,较之前提高了15~18倍,但热击对接合转移效率没有影响。3.由于纤维堆囊菌遗传操作的困难及不稳定性,菌株可能存在着某些限制外源基因进入或进入菌体后影响正常表达的限制修饰屏障。通过对纤维堆囊菌Soce157-2培养液、细胞壁和细胞内核酸酶活性分析,发现该菌胞内和胞外及菌体细胞壁上均存在核酸酶,能够降解外源基因,但尚未发现内源性质粒。并克隆了Soce157-2修饰性甲基化酶、甲基转移酶等限制修饰系统的部分基因。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2017-05-20）
孙宝婷,祝文兴,刘新利[3]（2017）在《产埃博霉素B纤维堆囊菌发酵条件的优化》一文中研究指出埃博霉素是纤维堆囊菌产生的一种和紫杉醇具有相同抗癌作用的大环内酯类次级代谢产物。以So ce2161为出发菌株,通过一系列单因素实验确定了对产量影响最大的四个因素,即温度、初始pH、转速、接种量。对四个因素设计正交实验进行发酵条件优化,最终得到最佳实验条件为使用250 m L挡板叁角瓶,在温度32℃、初始pH=7.2、转速180 r/min、接种量6%、装液量60 m L/250 m L、发酵时间6 d、种龄60 h条件下,埃博霉素B的产量为46.83 mg/L。(本文来源于《齐鲁工业大学学报(自然科学版)》期刊2017年02期）
荣雪媛[4]（2016）在《脂蛋白信号肽对纤维堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B定位的影响》一文中研究指出纤维堆囊菌S.cellulosum So0157-2能够在以滤纸或木聚糖为唯一碳源的无机盐平板上生长。由于纤维素和半纤维素的异质性和复杂性,它们的降解需要多种酶的协同作用,这说明纤维堆囊菌S.cellulosum So0157-2中含有丰富的纤维素和半纤维素降解酶系能够用来降解利用纤维素和半纤维素资源。纤维堆囊菌对不可溶性多糖底物的利用呈现接触性降解的特征。纤维素酶和木聚糖酶活力测定分析表明酶活力主要与细胞相关,而胞外组分活力极低。因此推测相关酶类主要与细胞相结合。已测序的So0157-2基因组分析发现：①基因组中很多多糖降解酶相关基因不具有引导目的蛋白分泌到细胞外的I-型信号肽,这与胞外酶活力极低现象吻合。表明其多糖降解酶类主要不是以分泌到细胞外的游离形式而发生协同作用。②相对于接触性降解的特征而言,So0157-2其基因组中也不含有纤维小体脚手架蛋白、粘附域、锚定域的同源基因序列,暗示着不存在纤维小体结构。因此,基因组信息显示纤维堆囊菌So0157-2降解不溶性多糖的策略既不是胞外游离酶组分的协同作用方式,也不是纤维小体的高效复合体方式,可能采用与两种经典的微生物纤维素降解策略所不同的方式实现其对多糖底物的降解。实验室前期对So0157-2木聚糖酶Xyn11B的分析发现其具有脂蛋白信号肽、多聚丝氨酸区域及糖苷水解酶11家族催化域。因为其前两个特征在目前研究过的多糖降解酶类中较为罕见而成为实验室研究关注的目标。对Xyn11B催化域的活性表达证明该酶组分在原始菌株纤维堆囊菌So0157-2中必然具有相应的生理功能。Xyn11B酶学性质研究中发现其对木聚糖水解产物只有木二糖的外切木聚糖酶特质,也是GH11家族内切木聚糖酶中未见报道过的。So0157-2木聚糖的酶Xyn11B脂蛋白信号肽及分拣序列特征引导的细胞定位与其底物降解特性和生理功能密切相关,也是解析其降解策略的基础之一。脂蛋白信号肽能够指引目的蛋白定位到内膜或外膜上,具体位置与信号肽切割位点后的氨基酸序列相关。实验室前期对纤维堆囊菌So0157-2的木聚糖酶活力进行测定,发现有超过1/2的木聚糖酶活力位于膜组分中,说明定位在膜上的木聚糖酶在木聚糖降解中发挥了重要的作用。本实验希望通过探究脂蛋白信号对木聚糖酶Xyn11B定位的影响,了解其脂蛋白信号肽及切点后的氨基酸序列对定位的影响规律,也会为推测纤维堆囊菌So0157-2的多糖降解方式提供一个证据。本实验对纤维堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B基因的N端脂蛋白信号肽及其切点后的氨基酸序列特征进行了分析,+2到+5位的氨基酸[DGGA]。对纤维堆囊菌So0157-2全基因组中的糖苷水解酶的生物信息学分析预测发现237个糖苷水解酶中有35个属于脂蛋白,237个中有9个为木聚糖酶。GH11家族中所有细菌的木聚糖酶生物信息学预测分析发现有19个属于脂蛋白,其中有5个来源于纤维堆囊菌。由于在本源菌中遗传操作的局限性,我们选择将木聚糖酶Xyn11B进行异源表达,分别选取了与纤维堆囊菌亲缘关系较近的黄色粘球菌DK1622和同为革兰氏阴性菌蛋白异源表达常用的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。设置了Xyn11B基因全长和去掉脂蛋白信号肽的Xyn11B-dlp两个对照实验组。在黄色粘球菌DK1622中,以pZJY41为表达载体,成功构建了pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp两个重组表达载体。利用anti-Flag单克隆抗体进行的Western Blot检测,确定了木聚糖酶Xyn11B在粘球菌DK1622表达。组分分离得到胞外浓缩组分(100倍)、细胞全破碎组分、胞内组分和膜组分。在Western Blot检测中,含pZJY41-X11B重组表达载体菌株检测到的强阳性信号在25kDa和33kDa处,分别为木聚糖酶Xyn11B催化域和去掉脂蛋白信号肽后表达产物,主要分布在胞内组分中。含pZJY41-X11B-dlp重组表达载体菌株只在25kDa处检测到阳性信号,主要分布于胞内组分。以上结果表明两个表达载体(pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp),无论设计是含有脂蛋白信号肽还是不含有,实际上表达出的蛋白已经从N-端截短,所以脂蛋白信号肽是不发挥作用的,从而使目的蛋白滞留在胞内。超薄切片制备过程中选取4%多聚甲醛-0.5%戊二醛进行菌体固定使菌体结构保存完好。免疫金标记前用10%H2O2刻蚀10min,免疫金颗粒实现对菌体细胞的特异性标记。免疫金标记结果显示含有pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp重组表达载体的两株菌的金颗粒都特异性的分布于胞内,与Western Blot检测结果相符合。将Western Blot与免疫金标记结果相结合,目的蛋白不明原因的降解或者剪切致使目的蛋白滞留在胞内,不能确定脂蛋白信号肽对木聚糖酶Xyn11B定位的影响。随后,将木聚糖酶Xyn11B在大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。以pET-22b为表达载体,成功构建了pET-22b-X11B和pET-22b-X11B-dlp两个重组表达载体,获得E.coli (22b)、E.coli (X11B)和E.coli (X11B-dlp)叁个菌株。以桦木木聚糖为底物的活性检测确定了目的蛋白的成功表达。通过组分细分得到了胞外浓缩组分、细胞全破碎、胞内组分、周质组分和膜组分。以p-半乳糖苷酶为胞内标志物,测定各组分中β-半乳糖苷酶的含量,说明组分分离过程和方法合适,分离的组分可以用于相应的后续检测。对各组分进行酶活测定,在E.coli (X11B)菌株中,有超过80%的木聚糖酶酶活力存在于膜组分中；在E.coli (X11B-dlp)菌株中,木聚糖酶酶活力在胞内组分和周质组分中分布较高。Western Blot检测中,E.coli (X11B)菌株检测到的强阳性信号在膜组分中；E.coli (X11B-dlp)菌株检测到的强阳性信号在胞内和周质组分中。而在免疫金标记结果中,在E.coli(X11B)菌株中分布于胞内,在膜上并没有预期的特异性金颗粒分布,可能由于蛋白上的His标签被膜上的磷脂分子阻挡不能与抗体发生特异性反应。在E.coli (X11B-dlp)菌株中,周质组分虽有少量金颗粒存在,还不能确定为特异性分布。将E.coli (X11B)和E.coli (X11B-dlp)两株菌检测结果对比说明,脂蛋白信号肽能够发挥指导木聚糖酶Xyn11B的膜定位功能。另外在缺乏脂蛋白信号肽的指引情况下,木聚糖酶Xyn11B出现了周质空间定位的现象,推测可能与其氨基酸序列有关。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-17）
马利云,龚国利,王娜[5]（2015）在《纤维堆囊菌SoF5-76产埃博霉素B分批发酵动力学研究》一文中研究指出埃博霉素发酵生产体系复杂,且生产菌株较难操作,导致发酵参数测定困难,迄今为止未见关于埃博霉素发酵动力学方面的报道。利用5 L发酵罐,对纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产埃博霉素B(Epothilone B)的分批发酵动力学进行了研究,整个发酵过程中维持温度30℃、p H7.4。发酵结束时,菌体干重达3.00 g/L,埃博霉素B产量达18.20 mg/L,葡萄糖含量为0.049g/L。基于Logistic方程和Luedking-Piret方程,利用MATLAB软件对其进行非线性拟合,构建了菌体生长、埃博霉素B合成和葡萄糖消耗的动力学模型。结果表明,该组模型能较好的拟合发酵过程。(本文来源于《生物技术通报》期刊2015年02期）
龚国利,黄宇莹[6]（2014）在《粘细菌纤维堆囊菌的基因组学研究现状》一文中研究指出纤维堆囊菌(S.cellulosum)属于粘细菌中的堆囊菌属,它们能产生丰富的次级代谢产物,而且是目前基因组最大的原核生物,现已测序的S.cellulosum So ce56和So 0157-2分别拥有13.03 Mb和14.78 Mb的环状染色体。本文阐述了这两株纤维堆囊菌在序列的组装验证和基因组的分析注释等方面的完成情况,以及人们在测序的基础上,对其展开的结构基因组学、比较基因组学和功能基因组学的研究。通过介绍这两株已测序纤维堆囊菌的基因组学研究现状,我们总结了从纤维堆囊菌的全基因组序列中挖掘遗传信息的方法,为发现纤维堆囊菌中新的功能基因提供一些参考。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2014年05期）
刘跃[7]（2014）在《纤维堆囊菌发酵过程中所用消泡剂的筛选及作用机理的研究》一文中研究指出埃博霉素是一类具有抗微管蛋白聚合的抗肿瘤药物。最初在粘细菌纤维堆囊菌的次级代谢产物中发现。其中，埃博霉素A，B最初在S. Cellulosum So ce90发现，并鉴定为16元大环内酯类化合物。相对于紫杉醇来说，其毒副作用小，结构相对简单，更易溶于水，是一种应用前景广阔的广谱抗癌药物。目前纤维堆囊菌已可以通过液体深层发酵，但是发酵过程产生过多的泡沫。泡沫可通过物理机械方法和化学消泡剂来控制。其中化学消泡剂以其操作简单，成本低廉，耗能少而得到应用广泛。但是消泡剂的添加往往是在没有充分了解的情况下添加到发酵过程中，对菌体生长的影响考虑较少。本文选择了4种天然油脂消泡剂和8种化学消泡剂。分别比较了消泡抑泡能力以及对菌体生长的影响。通过测定培养基中蛋白质含量，发现发酵培养基中含有较高的蛋白质含量(91.6μg/mL)，这是其容易起泡的原因之一。当M26培养基中添加0.10%的SXP107有机硅聚醚复合消泡剂时，可以提高19%的菌体量，因此作为种子培养基的消泡剂。添加0.10%的磷酸叁丁酯和0.06%THIX-298聚醚改性硅油能显着提高埃博霉素A/B，分别为31.41%/18.05%和48.12%/48.55%。SXP107有机硅聚醚复合消泡剂虽然对埃博霉素产量提高不大，但是其消泡抑泡能力显着。综合考虑消泡剂的消泡能力及对菌体和埃博霉素产量的影响，初步选择磷酸叁丁酯，聚醚改性硅油和SXP107有机硅聚醚复合消泡剂作为发酵培养基的消泡剂。为进一步了解消泡剂对菌体的影响，研究了SXP107，TBP，THIX-298消泡剂对pH，氨基氮和还原糖变化的影响以及对菌体量和埃博霉素产量的影响，同时研究了α-酮戊二酸脱氢酶复合体的酶活受两种消泡剂的影响。发现在M26培养基中，添加SXP107消泡剂提高了菌体利用营养物质的能力。在发酵培养基中，THIX-298消泡剂的添加也使得菌体利用碳源氮源的能力增强，而TBP消泡剂对其影响不大。同时OGDHC酶活受到THIX-298的影响较TBP高。发酵罐实验比较了消泡剂的多个参数如泡沫抑制系数，产量系数，成本系数和效率系数等。通过比较发现，THIX-298消泡剂效果最佳。并对添加浓度优化，发现消泡剂浓度对菌体干重，埃博霉素A，B的产量以及还原糖，氨基氮的影响并不大。因此选用体积分数为0.02%的THIX-298聚醚改性硅油消泡剂作为发酵所用消泡剂，0.10%的SXP107消泡剂作为种子罐的消泡剂。其最终选择的消泡剂通过500L发酵罐得到了进一步验证，其消泡抑泡效果较好，埃博霉素产量能够得到保证。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2014-06-12）
刘雪蕊[8]（2014）在《纤维堆囊菌So2161及其分散型突变株SoL4-29的差异研究》一文中研究指出纤维堆囊菌是抗癌新药埃博霉素的产生菌，其生长呈现聚团现象，这一特性是菌体的一种自我保护机制，但在一定程度上抑制了菌体的生长，影响了代谢产物的生成，也不利于基因操作。我们运用传统的紫外诱变手段以纤维堆囊菌So2161为出发菌株获得了分散型突变株L4，对其进行上清传代驯化，检测各代菌株的分散度、菌体量以及埃博霉素产量，最后选取第29代菌株作为分散型菌株的代表进行研究，命名为SoL4-29。本文分别从表型、胞外多糖产量、蛋白酪氨酸磷酸酶活性和sce8244基因表达量水平上对野生型菌株So2161和分散型菌株SoL4-29进行差异性比较研究。针对表型差异主要比较了两株菌在不同培养基中的形态差异、显微镜下的细胞形态、菌体生长速度、菌体量、分散程度几方面的异同。观察发现野生型菌株无论在固体培养基还是液体培养基中都聚团生长，而分散菌株在两种培养基中都呈现均匀分散生长性状，通过OD600值的检测进一步验证了两株菌的分散程度差异。另外，分散型菌株的生长速度相对野生型菌株有所提高，但菌体总量略有降低。胞外多糖是控制菌体分散性的重要因素，本文中首先用染料法检测野生型菌株和分散菌株的胞外多糖含量，使用刚果红和台盼蓝两种染料，菌体胞外多糖能够与染料结合，发生颜色的变化，通过检测两种染料的吸光度变化（刚果红490nm、台盼蓝585nm）来确定胞外多糖与染料的结合率，结果野生型菌株的两种染料结合率都高于分散菌株，其胞外多糖含量相对较高。为验证染料法的结果，进一步用苯酚硫酸法检测两株菌在5天的生长过程中胞外多糖每天的合成量，结果与染料法趋势相同。蛋白酪氨酸磷酸酶是与胞外多糖合成相关的酶，蛋白酪氨酸激酶能够促进酪氨酸磷酸化，蛋白酪氨酸磷酸酶又使其脱磷酸化，它们共同作用调节胞外多糖的合成。我们分别检测两株菌中蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，以磷酸对硝基苯（pNPP）为反应底物，加入粗酶液，通过检测生成的pNP的量来定义蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活，结果显示分散型菌株的酶活性较野生型菌株要高。Sce8244基因是一种蛋白酪氨酸磷酸酶基因，用实时荧光定量PCR分析此基因的表达量，以16S rRNA为内参基因，分别检测两株菌位于生长对数期和稳定期的sce8244基因表达量，结果显示，分散菌株的基因表达量高于野生型菌株，这与酶活检测结果一致说明蛋白酪氨酸磷酸酶与胞外多糖的含量呈现负相关。另外，我们在野生型菌株So2161培养基中添加重金属离子Mn2+和Co2+，当金属离子浓度在一定范围内时能够促进菌体不同程度地分散并且不影响菌体生长，但当金属离子浓度时过高则会造成菌体生长不良或致死。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2014-06-02）
王晓娜[9]（2014）在《纤维堆囊菌中丙酮酸激酶与埃博霉素合成关系研究》一文中研究指出埃博霉素是粘细菌纤维堆囊菌产生的具有抗癌作用的16元大环内酯类抗生素,作用机理与紫杉醇类似,但其由于水溶性好,分子结构简单,副作用小并且抗肿瘤谱广而备受研究者关注。目前已有商品化埃博霉素上市并应用于临床治疗中,但由于微生物发酵生产的产量低,大大限制了它的工业化推广。因此提高埃博霉素产量具有重要的理论意义和社会价值。丙酮酸激酶是糖酵解途径中最后个关键酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸,其催化产物丙酮酸是埃博霉素生物合成中重要的前体的之一。本论文对糖酵解途径的关键酶丙酮酸激酶(PK)与埃博霉素合成的相互关系进行分析研究。由于纤维堆囊菌本身基因组比较复杂,遗传背景不清晰,因此国内外对其尚无有效的基因敲除,质粒构建手段。在本论文工作中,我们采用了添加PK酶专一性抑制剂(维生素K3,VK3)和激活剂(果糖-1,6-二磷酸,FBP)的方法对丙酮酸激酶进行分析。考察其在不同生长条件(对照组,VK3,FBP)下,丙酮酸激酶酶活、菌体生长情况、pH值及还原糖含量变化趋势和埃博霉素产量之间的关系。结果显示在适当浓度下,效应剂可以在不影响初级代谢的情况下,对丙酮酸激酶酶活性及埃博霉素合成能力产生明显影响。随后我们从RNA层面对PK的转录情况进行了分析。在Sorangium cellulosum So2161中,编码丙酮酸激酶的基因有两段,分别是pyk sce5197和pyk sce4540。实验结果表明,S.cellulosum So2161中pyk sce4540和TE基因的表达,在VK3生长条件下它们受到了明显抑制作用,而在FBP件下其受到了明显的促进作用,但是pyk sce5197表达没有受到影响。这也可能解释了添加抑制剂VK3或激活剂FBP后埃博霉素产量发生明显变化但是菌体生长没有受到影响。结果表明在S. cellulosum So2161中,丙酮酸激酶是埃博霉素合成的关键酶之一。我们认为丙酮酸激酶在埃博霉素合成过程中可能发挥重要的作用,同时pyk sce5197是细胞生长的关键酶,pyk sce4540在埃博霉素生物合成中发挥重要作用。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2014-05-30）
李玺[10]（2014）在《纤维堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B催化域的结构与性质研究》一文中研究指出纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)能够在以结晶纤维素滤纸为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并伴随着有效的细胞接触性的滤纸降解。本实验室前期分离得到的一株埃博霉素产生菌S. cellulosum So0157-2可以利用滤纸或者木聚糖作为唯一碳源进行生长,其基因组中存在多个编码不同GH家族木聚糖酶的基因。实验室前期研究发现,S. cellulosum So0157-2的木聚糖酶具有一些特殊的酶学性质。在对S. cellulosum So0157-2中的一个GH11木聚糖酶Xyn11B的催化域Xyn11B-C进行酶学性质表征的过程中,我们发现Xyn11B-C除了具有一定的热稳定性外,还具有降解木聚糖只产生木二糖的特殊性质。后一性质在其他木聚糖酶中鲜有报道。本论文首先对Xyn11B-C降解糖链的方式进行了进一步的分析。我们对Xyn11B-C作用于PNP-X2和Xyn11B-C作用于ANTS-Xn的产物分别进行了检测,结果发现Xyn11B-C水解PNP-X2产物为PNP和木二糖；水解ANTS-X4. ANTS-X5、ANTS-X6释放X2。以上实验结果表明Xyn11B-C可以从糖链的非还原端切割并释放X2。实验室前期研究只是在氨基酸序列和酶学性质层面对Xyn11B-C以及其他纤维堆囊菌多糖降解酶进行了分析,并没有从蛋白质结构层面深入地研究纤维堆囊菌多糖降解酶降解底物的机制。为了对Xyn11B-C进行更深一步的了解,我们运用了蛋白质晶体学技术来探究Xyn11B-C的蛋白质叁维结构。在本论文中,我们构建了表达载体pGL01-Xyn11B-C,经大肠杆菌异源表达、亲和层析、切除标签、离子交换和分子筛纯化获得了符合结晶要求的Xyn11B-C的蛋白样品。经过结晶条件筛选和优化后获得了Xyn11B-C的蛋白结晶。晶体经X射线衍射和结构解析最终获得了Xyn11B-C的叁维结构。Xyn11B-C共由15个p折迭链和1个α螺旋组成,具有典型的GH11木聚糖酶的右手型结构,催化位点位于“手掌”中心。我们推测了Xyn11B-C的-1、-2两个亚位点的位置。根据Xyn11B-C与其他已有的GH11木聚糖酶的氨基酸序列和结构的比对结果,我们推测Xyn11B-C的两个loop L1(第214-227位氨基酸)和L2(第316-325位氨基酸)可能是造成Xyn11B-C降解底物只产生木二糖的原因。另外,本工作还尝试获得Xyn11B-C突变体与底物复合物的晶体,以期能了解Xyn11B-C与底物结合时的结构状态。我们纯化了Xyn11B-C(E331A/Q)两种突变了一个活性位点的蛋白,进行了共晶条件的筛选和一系列优化,目前获得了Xyn11B-C(E331Q蛋白晶体和叁维结构,并获得了Xyn11B-C(E331Q)-X3、 Xyn11B-C(E331Q)-X4、Xyn11B-C(E331Q)-X5复合物的晶体。综上所述,本论文在实验室对Xyn11B-C进行了初步酶学性质分析的基础上,进一步分析了Xyn11B-C降解木聚糖的方式,运用蛋白质晶体学技术解析Xyn11B-C和Xyn11B-C突变蛋白的结构,初步推测了Xyn11B-C蛋白结构及其与底物的结合方式,尝试从蛋白质结构层面解释Xyn11B-C具特殊的酶学性质的原因,揭示Xyn11B催化域序列特征、蛋白结构和生化性质之间的相互关系。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-01）
纤维堆囊菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
粘细菌按照其利用底物类型的差异,分为嗜细菌群和嗜纤维素群两大类,在嗜纤维素群中,纤维堆囊菌属是目前唯一可以分解纤维素的菌属。目前,纤维堆囊菌通过优化发酵技术的途径提高埃博霉素产量的研究已达到瓶颈,因此,利用合成分子机制提高次级代谢产物产量是目前纤维堆囊菌研究的重点,而建立高效的遗传操作体系是纤维堆囊菌研究的基础。此外,在粘细菌类群中,同一种属的不同菌株之间,其遗传操作同样也难以通用。本文应用的纤维堆囊菌Soce157-2,在菌体中尚未发现内源性质粒,因此,应用于纤维堆囊菌遗传操作的载体,需借助外源质粒来实现,其操作难度大且效率较低,而且纤维堆囊菌对大部分的抗生素都有抗性,所以,遗传标记的筛选范围较窄,限制了其分子水平研究的进展。上述基本状况是纤维堆囊菌遗传操作困难原因的一方面,另一方面是由于限制修饰系统的存在,明显阻碍或减少了外源DNA的进入。外源DNA由于没有被修饰过,一旦进入细菌内就会被降解,很大程度上影响了该菌遗传操作的成功率。基于上述分析,本文将在以下方面进行研究:1.对实验室所用菌株纤维堆囊菌So ce157-2进行了系统的生理生化反应和32种抗生素抗性的分析,为纤维堆囊菌的遗传操作和限制修饰系统的探究提供了可靠的生理生化基础,通过实验结果的分析和对前人实验的综合考虑,选用了氯霉素作为筛选标记。由于纤维堆囊菌不同于其他细菌,代时长,生长缓慢,极易染菌,因此,本文通过一系列单因素和正交实验对纤维堆囊菌So ce157-2生长条件进行了优化,得到最佳实验条件为:装液量60 mL/250mL,在温度32℃、初始pH9.0、接种量6%、生长时间72 h、种龄60 h条件下,纤维堆囊菌So ce157-2培养活性最佳。2.纤维堆囊菌的G+C含量高,载体自身的启动子元件由于G+C含量低于So ce157-2的G+C含量,无法正常表达氯霉素抗性,因此选用aphII作为启动子。经PCR扩增获得aphII启动子片段和氯霉素乙酰转移酶基因片段,将其连接后导入自杀质粒pCVD442中,构建pCVD442-cat载体,将从So ce157-2的基因组中PCR得到的叁段不同大小的片段分别导入pCVD442-cat载体中,获得pCVD442-cat-1、pCVD442-cat-2、pCVD442-cat-3叁种质粒,通过接合转移的方法从双质粒大肠杆菌中转移至So157-2中,阳性率达到了100%,建立了遗传操作系统。通过pH值及热击对接合转移效率影响的摸索,确定pH值为8.5至9.0时,接合转移效率最高,较之前提高了15~18倍,但热击对接合转移效率没有影响。3.由于纤维堆囊菌遗传操作的困难及不稳定性,菌株可能存在着某些限制外源基因进入或进入菌体后影响正常表达的限制修饰屏障。通过对纤维堆囊菌Soce157-2培养液、细胞壁和细胞内核酸酶活性分析,发现该菌胞内和胞外及菌体细胞壁上均存在核酸酶,能够降解外源基因,但尚未发现内源性质粒。并克隆了Soce157-2修饰性甲基化酶、甲基转移酶等限制修饰系统的部分基因。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
纤维堆囊菌论文参考文献
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