王盛[1]2002年在《珊瑚藻藻红蛋白的分离纯化与相关特性》文中认为在福建沿海地区采集了数量可观的天然大型藻类，经粗提液可见光光谱特性筛选(400～700nm)，从中找到叁种极为特殊的大型红藻，其藻体中仅含有R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin，R-PE)。通过进一步的比较分析，选择在福建沿海广为分布且周年可以生长的珊瑚藻(Corallina officinalis)作为实验材料。 经盐析、离子交换层析、羟基磷灰石吸附层析和凝胶过滤层析等分离纯化方法，从珊瑚藻中分离纯化出两种藻红蛋白(R-PE和r-PE)，其中R-PE纯度(OD_(565)／OD_(280))高达11左右，是目前国内外报道的藻红蛋白中纯度最高。对R-PE部分理化特性的研究结果表明，R-PE的分子量为194kD，与目前报道的多数R-藻红蛋白240kD的分子量不同；其α、β亚基分子量均为20kD左右，γ亚基分子量约为31kD，理论推测的R-PE亚基组成为(α β)_4γ，与前人报道的(α β)_6γ不同，而且其是否存在第四亚基还有待进一步证明；同时在变性条件下对R-PE的各亚基进行了分离纯化并对其各亚基可见光光谱特性作了研究。在R-PE与r-PE部分理化特性的比较研究中发现，在亚基组成上r-PE比R-PE缺失了31kD的γ亚基；在可见光光谱学特征方面，其最大吸收峰也比R-PE蓝移了10nm；在荧光光谱上，两者在荧光激发峰和发射峰的位置和荧光强度上也存在差异；通过比较讨论，对r-PE在藻胆体结构组成中可能的作用作了推测。在BCA法进行蛋白质定量的基础上，测定了R-PE的565nm和280nm的摩尔消光系数，它们分别为4.75×10~5mol~(-1)cm~(-1)和4.07×10~4mol~(-1)cm~(-1)。制备了R-PE的抗血清并对血清效价进行了测定，同时用Western-blot对血清特异性作了评价。 首次测定了珊瑚藻藻红蛋白α和β亚基基因的全序列(GenBank登录号：AF510986)，测定的基因序列长为1，140个碱基，包括β亚基起始密码子上游的10个碱基，6亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸)，101个碱基的间隔区以及α亚基编码区近5’端的495个碱基(编码164个氨基酸)。对其序列特征、各亚基在核酸和氨基酸水平上的同源性与已知基因序列的9种真核红藻作了比较分析。在比较分析结果的基础上，认为α和β亚基可以作为红藻分子生物学分类的标准之一。并对其γ亚基N-端的氨基酸进行了测定，测定的氨基酸序列在已知蛋白序列中未找到同源序列。 以双功能试剂SPDP为交联剂，从珊瑚藻中纯化的R-PE和购买的离子交 福建农林人学博1：学位论文2二 换纯化的羊抗兔抗体为标记材料，利用两步标记法获得藻红蛋白抡疫荧光探 针。引用渗滤法免疫试剂盒中常用的固相载体一硝酸纤维素膜为固相载体， 同时引用 DotELISA的操作试剂和方法，以烟草花叶病毒（TObacco mosaic vIYus，TMV）为试验检测对象，用两种荧光免疫分析方法进行了初步的应用研 究，并对四种不同的免疫分析方法的灵敏度作了比较。对如何进一步提高藻 红蛋白介导的免疫荧光分析方法的灵敏度作了深入的分析和讨论。
钟伏弟[2]2003年在《珊瑚藻R-藻红蛋白的分子生物学》文中提出本文报道了珊瑚藻(Corallina officinalis)藻红蛋白的全基因序列，首次报道了α和β亚基cDNA序列。根据藻红蛋白保守序列设计引物，扩增获得藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)α和β亚基的DNA序列(AF510986)。序列长为1，140个碱基，包括β亚基起始密码子上游的10个碱基，β亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸)，101个碱基的间隔区以及α亚基编码区近5’端的495个碱基(编码164个氨基酸)。在此基础上，采用RACE方法扩增获得α和β亚基的全长cDNA序列2257个碱基(AF542554)。cDNA序列排布顺序为5’UTR—rpeB—间隔区—rpeA—3’UTR，序列包括起始密码子上游493 bp的5’非编码区，β亚基编码区534bp(编码177个氨基酸)，基因间隔区101bp，α亚基编码区495 bp(编码164个氨基酸)以及终止密码子下游长为634 bp的3’非编码区，其中包含30个腺苷酸的poly(A)，首次通过实验证明了rpeA和rpeB确实是以多顺反子共转录的。 同时，测定了藻红蛋白γ亚基N-端的部分氨基酸序列为：S／A(G)-G-F-D-A-A-S-V-E-Y-P／A-N-A-P-S-F-A-G-K-Y(P83592)。基于N端序列设计简并引物，结合RACE方法扩增得到γ亚基的cDNA序列全长为2308个碱基(AY209894)。其中起始密码子上游5’非编码区为1203bp，编码区960bp(编码320个氨基酸)，终止密码子下游有一个长145bp的3’非编码区，其中包括26个腺苷酸的poly(A)。推导的氨基酸序列与我们通过蛋白质测序得到的N端部分序列完全一致。从γ亚基不同克隆子的测序结果，我们发现γ亚基存在不同的3’末端，表明γ亚基可能存在不同的拷贝形式。目前，有关γ亚基序列报道也仅见于Agluothumnion neglectum的两个序列(γ~(31)和γ~(33))，对γ亚基作进一步比较研究还有一定困难。此外，扩增获得γ亚基DNA序列，表明序列内部没有内含子存在。 最后，结合多种软件对以上序列进行生物信息学分析，对序列结构、特征、功能以及各亚基核酸和氨基酸的同源性等与已知真核红藻的基因序列作了比较分析。
王盛, 钟伏弟, 吴祖建, 林奇英, 谢联辉[3]2004年在《珊瑚藻R-藻红蛋白rpeA和rpeB基因全长cDNA克隆与序列分析(英文)》文中指出依据珊瑚藻 (CorallinaofficinalisL .)藻红蛋白rpeA和rpeB的DNA序列 (AF5 1 0 986 )设计引物 ,通过PCR RACE方法扩增得到rpeA和rpeB的cDNA序列 .序列分析表明 ,该序列采用多顺反子转录策略 ,全长 2 2 5 7bp(AF5 42 5 5 4) ,排布顺序为 5′UTR rpeB 间隔区 rpeA 3′UTR .5′非编码区 4 93bp ,rpeB基因 5 34bp ,基因间隔区 1 0 1bp ,rpeA基因 4 95bp ,3′非编码区 6 34bp .在rpeA和rpeB的基因起始密码子上游均存在类似原核核糖体结合的Shine Dalgarno (SD)序列 .在rpeA基因终止密码子下游 1 1 0bp处还存在着一个可能的开放阅读框架 .经检索GenBank发现 ,真核红藻藻红蛋白中尚无有关cDNA序列的报道
吴义诚[4]2009年在《紫球藻藻红蛋白β亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达》文中进行了进一步梳理藻红蛋白潜在的生物活性引起了广泛的重视,如体外的抗氧化活性以及作为光敏剂用于光治疗。藻类养殖及藻红蛋白纯化的高成本已成为藻红蛋白在医药和工业领域广泛应用的重要制约因素。本论文从紫球藻(Porphyridium cruentum)基因组DNA不同提取方法筛选,藻红蛋白β亚基基因的克隆,该亚基基因在巴斯德毕赤酵母中进行胞内和分泌表达等方面开展研究。主要实验结果如下:采用酚仿法、蛋白酶K法、盐析法、CTAB法和改良SDS法五种方法分别对紫球藻基因组DNA提取,结果显示提取的基因组DNA大小均约23 kb,五种方法所提的DNA纯度及产率有差别,蛋白酶K法提取的DNA得率最大,达3.31μg/μL,CTAB方法次之,但蛋白酶K法提取的DNA含有一些蛋白及RNA等杂质,改良CTAB法提取的DNA样品完整性相对较好,A_(260)/A_(230)和A_(260)/A_(280)分别为2.09和1.85。综合DNA提取纯度、得率、PCR扩增和酶切效果,CTAB法是五种方法中最适合紫球藻基因组DNA提取的方法。分别提取紫球藻(Porphyridium cruentum)基因组DNA和总RNA,根据藻红蛋白保守序列设计简并引物,采用PCR、RT-PCR获得紫球藻藻红蛋白β亚基、间隔序列及α亚基编码区近5'端cDNA和基因组DNA序列。cDNA序列长987个碱基,包括β亚基起始密码子上游的10个碱基,β亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸),105个碱基的间隔区以及α亚基编码区近5'端的338个碱基(编码164个氨基酸)。cDNA序列排布顺序为5'UTR-rpeB-间隔区-rpeA;对其基因组结构分析表明,藻红蛋白(Phyeoerythrin,PE)亚基基因编码区无内含子序列。获得紫球藻藻红蛋白β亚基cDNA片段,插入至巴斯德毕赤酵母表达系统胞内表达载体pPIC3.5K及分泌表达载体pPIC9K中,电转化整合至感受态毕赤酵母GS115中,用MD和MM培养基,筛选重组子,G418筛选出高拷贝整合菌株,甲醇诱导培养96小时后,SDS-PAGE分析表明,pPIC3.5K-PEβ-GS115重组酵母在胞内表达了分子量大小约19kD的重组蛋白,与紫球藻藻红蛋白β亚基分子量大小一致。
林丽琴[5]2011年在《紫球藻藻红蛋白基因的克隆及表达》文中研究表明藻红蛋白可作为天然色素应用于食品和化妆品工业,还可以作为光敏剂和荧光探针广泛应用于医药行业。本论文主要从紫球藻(Porphyridium cruentum)藻红蛋白亚基基因的克隆,该亚基基因在巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌BL21中进行异源表达等方面开展研究。主要实验结果如下：在本课题组吴义诚已克隆出藻红蛋白β亚基的基础上,利用LA-PCR技术扩增出紫球藻藻红蛋白β、α亚基及间隔区序列(GenBank登录号：HM535635),cDNA序列长1134 bp个碱基,包括p亚基编码区的534个碱基(编码177个氨基酸),105个碱基的间隔区以及a亚基编码区495个碱基(编码164个氨基酸)。cDNA序列排布顺序为5'UTR-peB-间隔区-peA,对其基因组结构分析表明,藻红蛋白(Phyeoerythrin, PE)亚基基因编码区无内含子序列。利用生物信息学的方法对α亚基的氨基酸序列,氨基酸组成,疏水作用,二级结构和叁级结构等方面进行了初步的分析和预测。结果显示,预测的藻红蛋白α亚基结构与不同来源的藻红蛋白α亚基结构十分吻合,同时它的结构特征也满足于捕光蛋白的特性。藻红蛋白α、p亚基分别亚克隆到毕赤酵母表达系统pPIC9K和大肠杆菌表达载体pET28a进行异源表达。重组的毕赤酵母表达载体pAO815-peA-peB、pPIC9K-peA分别转入Pichia pastoris GS 115,经甲醇诱导,SDS-PAGE电泳及DOT-BLOT分析,发现表达量过低。将藻红蛋白α、β亚基分别克隆到pET28a载体上,再分别转入E. coli BL21, IPTG诱导,WesternBlot分析有单一的条带出现,结果显示藻红蛋白α、β亚基在大肠杆菌表达系统中主要以包涵体的形式存在。对peB的密码子偏好进行了分析,结果表明peB在密码子使用上存在显着的偏好性,偏爱于使用以A或T结尾的密码子。将藻红蛋白亚基基因与大肠杆菌、毕赤酵母基因组的密码子偏爱性进行比较,结果表明,藻红蛋白亚基基因密码子用法与大肠杆菌、毕赤酵母差异较大,若要实现该基因在以上宿主中的高效表达则需对部分密码子进行改造。
闫国良[6]2007年在《坛紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白主要亚基基因的克隆及其蛋白表达与纯化的初步研究》文中指出藻红蛋白、藻蓝蛋白均为藻胆蛋白的一种,作为捕光和激发能传递物质,在藻类的光合作用中起重要的作用;作为储存蛋白,是价值很高的营养成分。不仅如此,藻红蛋白、藻蓝蛋白在免疫荧光技术、抗肿瘤药物开发、医疗保健药物开发、食品工业和精细化工工业等许多方面有很重要的应用价值和研究前景。本课题以坛紫菜叶绿体DNA为模板,根据GenBank中已知的藻红蛋白、藻蓝蛋白基因序列,设计简并引物,通过PCR扩增获得编码坛紫菜藻红蛋白、藻蓝蛋白的α、β亚基基因序列及两者之间的间隔序列。结果显示:坛紫菜藻红蛋白基因序列全长1103 bp,其中编码α亚基的序列长为495 bp,编码β亚基的序列长为534 bp,间隔序列为74 bp。该序列与GenBank收录的其它10种红藻的藻红蛋白基因序列的同源性在95.4 %～74.1 %,与蓝藻单歧藻相关序列的同源性为62.2 %。坛紫菜藻蓝蛋白基因序列全长为1071bp,编码坛紫菜藻蓝蛋白α亚基和β亚基的基因序列长度分别为489 bp和519 bp,两者之间的间隔序列长度为63 bp。该序列与GenBank收录的其它11种藻类的藻蓝蛋白基因序列的同源性在91.1 %～58.1 %。其中,编码区同源性更高,间隔序列变异较大。利用不同藻类的藻红蛋白、藻蓝蛋白DNA基因序列之间的同源性来计算它们之间的遗传距离,绘制系统进化树比较它们的亲缘关系;应用DS Modeling软件计算机模拟藻红蛋白、藻蓝蛋白亚基的叁维结构;对坛紫菜藻红蛋白、藻蓝蛋白各亚基氨基酸组成进行氨基酸模式分析,对其营养价值进行评估。分别以pMD18-T-cpeAB和pMD18-T-cpcAB质粒为模板,用带有BamHI和XhoI限制性酶切位点的特异引物PCR扩增目的基因cpeAB与cpcAB,并对PCR产物进行双酶切(BamHI+XhoI),与相同的内切酶双酶切的pTO-T7质粒连接,分别构建能够同时高效表达坛紫菜藻红蛋白、藻蓝蛋白α亚基和β亚基的共表达载体pTO-T7-cpeAB和pTO-T7-cpcAB。将pTO-T7-cpeAB和pTO-T7-cpcAB表达质粒分别导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果显示:构建的共表达载体能同时表达α和β亚基,两个亚基的分子量分别为19.0KD和17.5KD左右。表达菌在37℃, 1.0 mmol/L的IPTG,诱导3h时,重组蛋白表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上,并且两个重组蛋白都是以不溶性包涵体蛋白的形式存在。IPTG浓度优化实验结果表明:当IPTG浓度为很低的0.01 mmol/L时,也能诱导表达目的蛋白;当IPTG浓度从0.05～1.0 mmol/L之间时,目的蛋白诱导表达量无显着性差别,均在菌体总蛋白的50 %以上。诱导表达的重组藻红蛋白、藻蓝蛋白分别经DOC洗涤、0.6 % SKL溶解后,再经Sephadex G-100凝胶层析,对收集的洗脱峰蛋白溶解液进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明得到的目的蛋白已达到电泳纯。
付晓苹[7]2007年在《红毛藻及坛紫菜藻红蛋白的分离纯化与相关性质的研究》文中进行了进一步梳理本研究以营养价值高且蛋白质含量丰富的红毛藻为原材料,通过硫酸铵分级盐析和阴离子交换柱层析两种方法结合,快速高效地分离纯化红毛藻藻红蛋白,并对该蛋白的光谱学性质,亚基组成,稳定性,抗氧化性及食用安全性等进行研究。此外,为了对藻红蛋白的性质作深入了解,本研究还从坛紫菜中分离纯化藻红蛋白,并对这两种藻红蛋白的性质进行了比较分析。本实验首次采用盐浓度线性梯度和pH值线性梯度相结合的混合梯度方式对吸附于DEAE-Sepharose阴离子交换柱的蛋白进行洗脱,从而分离纯化得到高纯度藻红蛋白。最终纯化的红毛藻藻红蛋白的纯度系数(A565/A280)为4.5,得率约为0.8 g/100 g红毛藻;坛紫菜藻红蛋白的纯度系数为3.6,得率约为0.1 g/100 g坛紫菜。根据其可见光光谱学特征判断两种藻红蛋白均属于R-藻红蛋白,荧光发射峰位于572 nm左右。红毛藻藻红蛋白的α、β和γ亚基的相对分子质量分别约为19 kDa、21 kDa和27 kDa。坛紫菜藻红蛋白的α、β和γ亚基的相对分子质量分别约为21 kDa、22 kDa和32 kDa。稳定性实验结果表明:藻红蛋白在pH值为中性及偏酸性时,具有较好的稳定性,pH值为强碱性时,蛋白不稳定。藻红蛋白在温度低于50℃时具有良好的稳定性。短时间可见光、紫外光照射对藻红蛋白的吸收光谱特征影响较小,而短时间红外光照射对蛋白稳定性有一定程度的破坏,故要长时间保存该蛋白仍须低温、避光。此外,微波对藻红蛋白有较强的破坏力。藻红蛋白具有抗氧化活性,特别是红毛藻藻红蛋白具有很强的清除羟基自由基和过氧化氢的能力。红毛藻藻红蛋白对羟基自由基的半数清除率(IC50)为1.2μg/mL,对过氧化氢的半数清除率为4.8μg/mL。坛紫菜藻红蛋白对羟基自由基的半数清除率为11.5μg/mL,但是,坛紫菜藻红蛋白清除过氧化氢的能力未被检测到。红毛藻藻红蛋白的急性毒性实验表明该蛋白的毒性极低。
参考文献：
[1]. 珊瑚藻藻红蛋白的分离纯化与相关特性[D]. 王盛. 福建农林大学. 2002
[2]. 珊瑚藻R-藻红蛋白的分子生物学[D]. 钟伏弟. 福建农林大学. 2003
[3]. 珊瑚藻R-藻红蛋白rpeA和rpeB基因全长cDNA克隆与序列分析(英文)[J]. 王盛, 钟伏弟, 吴祖建, 林奇英, 谢联辉. 中国生物化学与分子生物学报. 2004
[4]. 紫球藻藻红蛋白β亚基基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D]. 吴义诚. 福建师范大学. 2009
[5]. 紫球藻藻红蛋白基因的克隆及表达[D]. 林丽琴. 福建师范大学. 2011
[6]. 坛紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白主要亚基基因的克隆及其蛋白表达与纯化的初步研究[D]. 闫国良. 厦门大学. 2007
[7]. 红毛藻及坛紫菜藻红蛋白的分离纯化与相关性质的研究[D]. 付晓苹. 集美大学. 2007
标签：生物学论文; 毕赤酵母论文; 蛋白质纯化论文; 基因结构论文; 简并碱基论文; 酸性氨基酸论文; 编码序列论文; 序列模式论文; 科学论文; 科普论文;