常氧及缺氧环境下人尿源干细胞外泌体中微小RNA的表达谱分析

论文摘要

目的:对常氧及缺氧环境下人尿源干细胞外泌体中微小RNA的表达谱进行比较分析。方法:采用优化后的尿液收集装置对健康成年男性新鲜尿液进行采集,利用“一次离心法”分离出尿液中的人尿源干细胞（hUSCs）,将其培养至P3,将培养后的细胞进行分组,分为常氧及缺氧48h两组;通过流式细胞术鉴定其表面标记物,CCK-8法绘制其生长曲线进行比较,对常氧和缺氧组的人尿源干细胞（hUSCs）进行体外的成骨成脂诱导使其分化,利用Von Kossa、茜素红、碱性磷酸酶、油红O染色对其分别鉴定并进行对比;利用改进后的超高速离心法从常氧和缺氧48小时的hUSCs培养清中提取hUSCs-Exo,采用透射电镜的方法分析提取的hUSCs-Exo形态,并利用NTA法分析其浓度和大小,最后利用蛋白质免疫印迹法（WB）对其特异性蛋白CD9、CD63和HSP70的表达情况进行分别检测,利用已完成鉴定的两组hUSCs-Exo将常氧组及缺氧组中提取的已鉴定的hUSCs-Exo,使用Small RNA Library Prep Kit for Illumina?构建文库,在构建文库后,使用Qubit 3.0进行初步量化,随后使用Agilent 2100Bioanalyzer对文库大小范围进行检测,在插入片段的大小与预期一致后,使用Q-PCR方法准确定量文库的有效浓度（文库有效浓度2nM）以确保文库质量。在文库合格后,不同的文库根据有效浓度和目标数据量合并,并使用HiSeq PE150模式进行测序,进行miRNA的基因测序及分析。结果:细胞形态均呈典型“纺锤形”或“梭形”;缺氧组细胞相较于常氧组细胞的增长速率更快,并且两者的增长曲线都为“S”形;人尿源干细胞（hUSCs）的阳性表达间充质干细胞特异的表面标志物为CD44、CD73、CD105和CD90;常氧及缺氧组均具有诱导成骨及成脂分化的潜力,且缺氧组（N-hUSCs）成骨效果要好于常氧组（Hp-hUSCs）。经过超速离心,提取得到附着在离心管底侧壁常氧及缺氧组中的白色沉淀。透射电镜下观察:形状主要是形态一致类圆形的茶托样结构,样本大小大约在30nm至200nm之间。通过NTA检测:N-hUSCs/Hp-hUSCs组囊泡大小主要为30-170nm,且浓度分别为4.28×107/ml、2.37×107/ml,缺氧组要高于常氧组。蛋白质免疫印迹法检测结果显示,常氧和缺氧组中外泌体均阳性表达国际上通用的保守蛋白CD9、CD63和HSP70。通过高通量测序检测到Hp-hUSCs外泌体中共有8516641条干净序列,miRNA数量为1693个,N-hUSCs外泌体中共有7545238条干净序列,miRNA数量为1063个,其中差异表达的miRNA共92条,表达上调的miRNAs有55个,在其中发现有37个缺氧组特有表达的miRNAs:hsa-miR-132-5p、hsa-miR-4473、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-629-3p等。表达下调的miRNAs有37个。表达差异较为显著的上调miRNA有hsa-miR-132-5p、hsa-miR-4473、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-185-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-135a、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-493-3p等,其中与组织修复相关的包含hsa-miR-375、hsa-miR-135a、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-493-3p等,信息学分析结果提示,差异表达的miRNA参与组织修复、细胞增殖及分化、生长周期、神经调节过程等生物学过程。结论:常氧及缺氧环境下人尿源性干细胞外泌体中miRNAs表达谱存在明显差异;

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄强

导师: 黄桂林,张元原,王帅,张霓霓

关键词: 尿源干细胞,外泌体,高通量测序,微小

来源: 遵义医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 遵义医科大学

基金: 国家自然科学基金(基金课题合同编:81860193),贵州省自然科学基金计划(黔科合基础[2016]1170)

分类号: R329.2

总页数: 60

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