毛白杨PtoABCG40基因的克隆与功能分析

论文摘要

杨树具有生长迅速、适应性强、分布范围广等特点,是我国重要的绿化造林和工业用材树种。然而,在自然环境中,杨树在其生命周期常常遇到一些生物及非生物胁迫,例如病虫害、干旱、水涝、低温、高盐及土壤化学污染等。这些胁迫导致杨树生长延缓、分布范围减小、生产力降低甚至死亡。其中干旱胁迫对杨树的分布及生长发育的影响尤为严重。因此选育出速生、抗旱的杨树新品种是目前杨树育种工作中迫切需要解决的问题,其中通过现代生物学技术向杨树基因组中引入新的抗逆基因是一种非常具有前景的策略。脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,在植物响应生物和非生物胁迫中发挥关键作用。在低温、干旱、高盐等逆境胁迫下,植物体内的ABA含量就会上升,由此激活ABA信号转导途径并引发下游一系列的生化生理反应对植物适应逆境胁迫具有重要意义。比如植物在受到干旱胁迫时,体内ABA水平上升的信号被保卫细胞感知到后,气孔即会关闭以减少蒸腾作用,降低水分的散失,从而增强抗旱性的生理功能。ATP结合盒（ATP-Binding Cassette,ABC）转运蛋白是广泛存在于生物体中的一类大家族转运蛋白,其中ABCG是最大的亚家族,它们在植物器官的生长发育、表皮角质层形成、激素运输、次生代谢产物分泌、抵御生物和非生物胁迫以及植物与微生物互作等方面扮演着非常重要的作用。如拟南芥AtABCG25和AtABCG40促进ABA向保卫细胞转运,调控气孔开闭,增强植物的耐旱性。目前关于杨树的耐旱性研究主要集中在传统的杂交育种以及通过导入外源基因从而加强植物细胞内脂膜过氧化保护酶系统方面来增强转基因植株的抗旱性。从激活ABA信号通路调控保卫细胞气孔开闭角度来增强杨树抗旱性的研究还鲜有报道。基于拟南芥AtABCG40在植株抗旱方面的功能,我们试图在杨树中克隆类似的基因,并验证该基因的功能,并将其应用于杨树耐旱育种中。本研究从毛白杨（Populus tomentosa）中克隆得到PtoABCG40基因,构建了植物过表达载体并将其转入野生型拟南芥和毛白杨植株中,然后对转基因植株进行了抗旱试验分析其功能。具体研究结果如下:（1）PtoABCG40基因的克隆与生物信息学分析以毛白杨cDNA为模板克隆得到的PtoABCG40基因,经测序得出该基因CDS全长为4350 bp,编码1449个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PtoABCG40属于PDR型转运蛋白,结构为NBD-TMD-NBD-TMD;该蛋白与拟南芥、毛果杨、胡杨的ABCG蛋白进化关系最近。推测其可能和AtABCG40具有类似功能,与干旱胁迫响应中发挥关键作用的ABA信号通路有关。（2）PtoABCG40基因的组织表达和胁迫诱导表达分析通过荧光定量PCR检测了PtoABCG40基因在各组织中的表达量,结果显示PtoABCG40在根、茎、叶和叶柄中均有表达,叶中的表达量最高。在干旱胁迫诱导下,PtoABCG40在各组织中的表达量均呈上升趋势。（3）PtoABCG40蛋白的亚细胞定位分析构建35S:PtoABCG40-GFP融合蛋白表达载体,将其在烟草叶片中进行瞬时表达,发现PtoABCG40定位在细胞质膜和内质网上。（4）过量表达PtoABCG40转基因植株的干旱耐受性分析通过农杆菌介导的遗传转化法,将含PtoABCG40基因重组载体质粒转入野生型拟南芥和毛白杨中,获得转基因植株。在含20%PEG的植物培养基上分别统计野生型和转基因拟南芥种子的萌发率以及观察根表型,结果显示转基因拟南芥种子的萌发率明显比野生型低。同时,根毛也明显比野生型拟南芥多。且在干旱胁迫情况下,转基因拟南芥植株的抗旱能力明显优于野生型植株。（5）PtoABCG40基因过量表达对气孔开闭的影响分析在气孔关闭和开放实验中,在ABA处理前,转基因株系、野生型和突变体株系的气孔的孔径大小无明显差异,然而在经过50μM的ABA诱导之后转基因植株的气孔孔径明显比野生型和突变体小。说明过表达PtoABCG40可以增强气孔对外源ABA的敏感性,从而促进气孔的快速关闭。（6）保卫细胞中K+流速分析在10%PEG-8000处理之前,所有材料保卫细胞中K+的平均流速均为负,表明此时保卫细胞中主要发生K+流入,且这些离子流量大小无明显差异。然而,PEG-8000处理十分钟后,所有材料保卫细胞中K+平均流速均为正,表明在PEG-8000胁迫条件下保卫细胞中主要发生K+流出,转基因拟南芥植株保卫细胞中K+平均流速明显高于野生型和突变体植株。结果表明在PEG-8000胁迫条件下,过量表达PtoABCG40能够更快的促进保卫细胞中K+外排,进而使气孔快速关闭。（7）PtoABCG40基因过量表达促进了植物中ABA的运输通过统计野生型和转基因拟南芥种子在含ABA的1/2MS培养基上的萌发率发现,转基因拟南芥萌发率比野生型更低,这暗示了PtoABCG40促进了ABA运入拟南芥种子中。进一步用ABA处理拟南芥幼苗根部,结果表明转基因拟南芥植株对ABA的吸收率更大,这说明了PtoABCG40促进了ABA从地下部分向地上部分的运输。综上所述,本实验结果初步证明了在植物中过量表达PtoABCG40基因能够有效提高植物对干旱胁迫的耐受性。因此,PtoABCG40可作为一个优异候选基因去遗传改良植物的干旱耐受性,为我们培育出具有广泛适应性的杨树耐旱新品种奠定基础。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 植物常见的逆境胁迫

1.2 植物干旱胁迫响应相关研究进展

1.3 杨树耐旱育种相关研究进展

1.4 ABCG转运蛋白研究进展

1.4.1 PDR类型

1.4.2 WBC类型

第2章引言

2.1 研究目的和意义

2.2 研究内容

2.2.1 生物信息学分析

2.2.2 目的基因扩增

2.2.3 表达特异性分析

2.2.4 亚细胞定位分析

2.2.5 PtoABCG40 的功能研究

2.3 技术路线

第3章实验材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌种及质粒

3.1.3 仪器设备

3.1.4 试剂及试剂盒

3.1.5 细菌培养基及植物培养基

3.1.6 其他试剂

3.1.7 激素、抗生素和其他母液

3.2 实验方法

3.2.1 植物RNA提取

3.2.2 植物DNA提取

3.2.3 植物表达载体的构建

3.2.4 拟南芥的遗传转化

3.2.5 杨树的遗传转化

3.2.6 毛白杨PtoABCG40 的组织表达水平检测

3.2.7 烟草表皮细胞瞬时表达

3.2.8 野生型与转基因拟南芥的萌发率统计

3.2.9 ABA 调控气孔的关闭与张开实验

3.2.10 保卫细胞中K+流速检测

3.2.11 相对含水量与失水率的检测

3.2.12 拟南芥的干旱胁迫实验

3.2.13 ABA的提取及测定

3.2.14 数据分析

第4章实验结果与分析

4.1 PtoABCG40 基因的克隆与生物信息学分析

4.1.1 PtoABCG40 基因的克隆

4.1.2 生物信息学分析

4.2 PtoABCG40 的组织表达特异性分析

4.3 干旱胁迫处理下PtoABCG40 的表达量分析

4.4 PtoABCG40 的亚细胞定位分析

4.5 转基因植株的获得和验证

4.6 转基因植株的抗旱性分析

4.6.1 拟南芥植株的干旱耐受性分析

4.6.2 干旱胁迫对拟南芥种子萌发以及根表型的影响

4.7 PtoABCG40 对气孔开闭的影响

4.7.1 PtoABCG40 对拟南芥植株气孔开闭的影响

4.7.2 PtoABCG40 对杨树植株气孔开闭的影响

4.8 保卫细胞中K+流速检测

4.9 PtoABCG40 过量表达促进了植物中ABA的运输

第5章结论与讨论

5.1 结论

5.1.1 PtoABCG40 基因的克隆与组织表达分析

5.1.2 过量表达PtoABCG40 能够增强植株的抗干旱能力

5.1.3 过量表达PtoABCG40 增加了拟南芥种子在干旱胁迫下的萌发率及根毛密度

5.1.4 PtoABCG40 基因过量表达能够增强气孔对ABA的敏感性

5.1.5 过量表达PtoABCG40 能够促进保卫细胞中K+外排

5.1.6 过量表达PtoABCG40 能够增强拟南芥中ABA的运输

5.2 论文的创新点

5.3 讨论

5.4 展望

参考文献

附录

致谢

在读期间发表论文及参加课题

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭再慧

导师: 王邦俊

关键词: 毛白杨,耐旱性,气孔

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 西南大学

分类号: Q943.2;S792.117

DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000040

总页数: 73

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毛白杨PtoABCG40基因的克隆与功能分析

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