湖南省衡阳市妇幼保健院421001
摘要：目的：研究耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药机制，为指导临床合理使用抗菌药物提供依据。结果：药敏试验显示对肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌最有效的抗生素是亚胺培南，耐药率最高的药物是头孢吡肟，二者对同种抗菌药物的耐药率差异不大。改良Hodge试验显示为阳性的菌株共3株（8.33%），其中2株为肺炎克雷伯菌，1株为大肠埃希菌。基因检测结果显示含有KPC基因的菌株有3株，OmpK35基因缺失16株，OmpK36基因缺失6株。结论：36株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对碳青霉烯酶的耐药程度增高的主要原因是产生耐药酶和膜孔蛋白基因缺失。
关键词：碳青霉烯酶；肺炎克雷伯菌；大肠埃希菌；耐药
肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌都是临床中检出率极高的常见的病原菌，都属于肠杆菌科[1]。他们的感染力强、发病急、对于多种抗生素天然耐药。近几年抗生素在临床的使用增加使其耐药性进一步增加，使临床上可使用的抗生素越来越少[2]。为了了解这两种细菌的耐药机制，我院收集了36株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，从分子机制上对其耐药机制进行研究，现报道如下。
1资料与方法
1.1菌株来源及鉴定
36株耐碳青霉烯酶菌全部来自2012年10月-2013年9月我院住院患者的临床标本，其中大肠埃希菌20株，肺炎克雷伯菌16株。标本分布为：痰液19份，尿液12份，脓液5份。菌株使用VITEK-compact全自动细菌分析仪进行鉴定。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC700603和大肠埃希菌ATCC25922。
1.2药敏试验
通过K-B纸片法（药敏纸片和MH平板均来自英国Oxoid公司）测定所有菌株对12种抗生素的耐药性，药敏试验抗菌药物包括：头孢唑林、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、阿莫西林/克拉维酸等。药物敏感性的判断以2011年美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）的标准进行。
1.3改良Hodge试验
将0.5麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922用无菌生理盐水稀释10倍并涂布至MH平板上，平板的中间贴1片含10μg厄他培南的纸片。用无菌接种环挑取待测菌从药敏纸片边缘向平板的边缘划线，于35℃恒温培养箱中孵育。若厄他培南的抑菌圈内部有菌生长，则该菌视为阳性。
1.4基因检测
基因检测为PCR法，检测KPC、OmpK35、OmpK36基因。细菌的总DNA模板通过加热裂解法得到。构建50μLPCR反应体系，其中上游引物和下游引物（上海生工公司合成）各2μL，2*PCRmix25μL，细菌DNA模板4μL，不含RNA水解酶的灭菌蒸馏水18μL。反应条件：94℃5min，94℃30s，53-55℃（见表1）60s，72℃30s，循环35次，72℃延伸10min。K扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测，Marker为DL2000DNAMarker（takara），将电泳产物与6*Loadingbuffer混合点样。PCR引物序列（KPC、OmpK35、OmpK36的基因引物序列源自文献[3，4]）见表1。
1.5阳性基因测序
将PCR的阳性产物送至铂尚生物技术有限公司（上海）测序，测序结果用软件Chromas读取并进行BLASTSearch比对，与GenBank上的基因序列对比计算相似率。
1.6统计学处理
药敏试验所得数据用SPSS17.0进行统计学处理，用χ2检验进行显著性分析，P＜0.05则差异具有统计学意义。
2结果
2.1药敏试验结果
药敏试验结果显示对于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌最有效的抗生素是亚胺培南，耐药率最高的是头孢吡肟。同时，二者对于同种抗菌药物的耐药率差异不大（P>0.05）。详细结果见表2.
3讨论
随着最近几年碳青霉烯酶类抗生素在临床上的使用增加，越来越多的临床分离株对碳青霉烯酶类抗生素产生了耐药性。根据国外有关的报道[5]，2005-2008年对肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的耐药率为日本1.13%、1.2%、1.31%、1.4%；法国0.71%、0.75%、0.81%、0.86%；澳大利亚0.37%、0.41%、0.46%、0.5%，呈现逐年上升的趋势。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药的原因主要有以下几个方面[6]：（1）GES、KPC、SFC-1、SME等耐药酶的产生；（2）ATP结合盒超家族（ABC）、主要易化子超家族（MFS）、耐药结节化细胞分化家族（RND）等外排泵的产生；（3）整合子的产生；（4）外膜屏障的产生。本组研究中，36株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌进行改良Hodge试验有3株阳性，说明这3株菌可以产生碳青霉烯酶。通过PCR进行基因检测共有3株含有KPC基因。但是改良Hodge试验有可能出现假阳性，若菌株含有GES、SME等基因或者含有VIM、IMP等编码B类金属酶的基因，也可以产生碳青霉烯酶，编码碳青霉烯酶的基因可以位于整合子上通过转座子、质粒的移动在各细菌之间传播。综合以上研究，还显示缺失OmpK35、OmpK36的菌株对4代头孢（头孢吡肟）的耐药率大幅升高，菌株对4代头孢产生耐药性的主要原因是细菌膜孔蛋白的缺失，即产生了外膜屏障。综上所诉，耐药酶的产生、转座子的携带使耐药基因转移、编码膜孔蛋白的基因OmpK35、OmpK36缺失都是耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药的机制。细菌耐药性增加是由许多种机制共同作用的结果，而细菌耐药性增强和耐药机制越来越复杂的主要原因是抗生素的滥用，这应当引起我们足够的重视。
参考文献：
[1]Bushk，JacobyGA.Updatedfunctionalclassificationofβ-lactamases[J].AntimicrobAgentsChemother，2010，54（3）：969-976.
[2]RossoML，ChauvauxS，DesseinR，etal.GrowthofYersiniapseudotuberculosisinhumanplasma：impactsonvirulenceandmetabolicgeneexpression[J].BMCMicrobiol，2008，3（8）：208-211.
[3]梁权辉，徐韫健.耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌耐药机制研究[J].国际检验医学杂志，2014，35（2）：166-167.
[4]范爱民，田秀红.大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药机制检测[J].山西医药杂志，2011，40（9）：877-878.
[5]ToyamaM，SasakiM，HirayamaN，etal.Constructionofanadditionalmetal-bindingsiteinhumanmetallothionein-2[J].BiosciBioeng，2006，101（4）：354-360.
[6]安军，蔡挺，张顺.耐碳青霉烯酶类大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌多重耐药研究进展[J].现代实用医学，2011，23（3）：359-360.