杆状病毒AcMNPV口服感染因子P74的剪切位点鉴定

论文摘要

杆状病毒是一类具有囊膜的双链环状DNA病毒,在其生活史中,产生两种不同类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子（budded virus,BV）和包埋型病毒粒子（occlusion-derived virus,ODV）。ODV负责病毒对中肠初始的口服感染,而BV则介导虫体其他组织之间的系统感染。在ODV囊膜表面分布着至少10个与口服感染相关的蛋白,被称为口服感染因子（per os infectivity factors,PIFs）。P74作为首个被报导的口服感染因子,也被称为PIF0,它在ODV感染中肠的过程中经历两次顺序剪切:第一次剪切发生于ODV从多角体（occlusion body,OB）碱解释放的过程中;第二次剪切发生于ODV感染中肠上皮细胞的过程中。目前,对于P74第一次剪切的具体位点及其对口服感染的影响尚不明确。本论文对ODV囊膜蛋白P74的剪切现象进行了深入分析研究,同时还探究了ODV囊膜表面口服感染因子间的相互作用,为深入揭示杆状病毒口服感染的机制奠定了基础。第一章介绍了研究背景,包括杆状病毒的生活史及口服感染的详细过程。同时对口服感染因子,特别是P74的研究现状进行总结分析。第二章对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）P74蛋白的剪切进行了研究。使用感染细胞样品和虫体来源的ODV样品进行Western blot检测,发现P74在细胞中不发生剪切,而在ODV样品中发生剪切。随后使用特异性抑制胰酶活性的大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor,SBTI）进行OB碱解的时相实验,发现SBTI加入时间越晚,P74剪切后的蛋白量越多,由此我们认为P74第一次剪切的可能是由胰蛋白酶或是类胰蛋白酶介导的。随后,根据剪切条带的大小及生物信息学分析,推测了四个保守的精氨酸位点可能为剪切位点,并通过Bac-to-Bac系统构建了缺失p74,回复p74及七种预测剪切位点单、多点组合突变的重组病毒。我们对重组病毒进行扫描电镜及透射电镜观察,发现p74缺失及点突变不影响OB的外部形态及内部ODV的包埋。我们将重组病毒的ODV纯化后进行Western blot检测,发现点突变R325Q/R334Q能够部分抑制P74剪切,四点突变R319Q/R323Q/R325Q/R334Q能够完全抑制P74的剪切,而其他的突变体不能,表明P74发生第一次剪切的位点是第319、323、325和334位的精氨酸。第三章对AcMNPV ODV囊膜表面10个口服感染因子之间的相互作用进行了探究。该实验通过酵母双杂交的方法双向验证各个PIF之间的相互作用,除去PIF5和VP91存在自激活现象无法研究外,共发现了8对双向互作的蛋白,分别是:P74-PIF4、PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF2-PIF3、PIF2-PIF4、PIF3-PIF4、PIF4-Ac110。该实验提示PIFs之间存在着广泛的相互作用,支持了PIF以复合物形式发挥功能这一发现,并为探究各个PIF蛋白在PIF复合物中可能的排布方式提供了重要数据。第四章为总结和展望,对本文的研究进行了总结归纳。

论文目录

摘要

abstract

第1章引言

1.1 杆状病毒概述

1.1.1 杆状病毒生活史

1.1.2 杆状病毒结构

1.1.3 杆状病毒的应用

1.2 口服感染及口服感染因子

1.3 口服感染因子间相互作用

1.3.1 常用鉴定蛋白互作的手段

1.3.2 AcMNPV口服感染因子之间的互作研究

1.4 P74的结构与功能研究

1.4.1 P74的结构

1.4.2 P74的剪切及功能研究

1.5 本文研究内容与意义

第2章 AcMNPV口服感染因子P74剪切位点的鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 细胞系、病毒株、昆虫、质粒和菌株

2.1.2 AcMNPV P74N端单克隆抗体的制备

2.1.3 p74缺失型重组病毒的构建

2.1.4 p74回复型及点突变重组病毒的设计与构建

2.1.5 野生型,重组型OBs及ODVs的扩增及纯化

2.1.6 感染细胞样品与虫体来源ODV样品检测P74剪切

2.1.7 胰酶抑制剂在虫体来源野生型OBs裂解过程对P74剪切抑制的时相分析

2.1.8 野生型,缺失型及回复型重组病毒一步生长曲线的测定

2.1.9 透射电镜和扫描电镜观察

2.1.10 Western blot分析

2.1.11 引物

2.2 结果

2.2.1 AcMNPV P74N端单克隆抗体的制备

2.2.2 虫体来源ODV与感染细胞来源中AcMNPV P74的剪切分析

2.2.3 AcMNPV P74第一次剪切是由胰蛋白酶或类胰蛋白酶介导

2.2.4 野生型、缺失型及P74可能的剪切位点突变型的重组病毒的构建

2.2.5 p74 的缺失及回复不影响病毒BV的形成

2.2.6 p74 缺失及点突变不影响OB的外部形态及ODV在其中的包埋

2.2.7 P74的第一次剪切可被突变体抑制

2.3 讨论

2.4 本章小结

第3章 AcMNPV口服感染因子之间的酵母双杂交分析

3.1 材料与方法

3.1.1 病毒DNA、菌株及其他试剂

3.1.2 AcMNPV PIFs的跨膜区分析

3.1.3 酵母双杂交系统

3.1.4 Prey蛋白及Bait蛋白克隆的构建

3.1.5 转化酵母

3.1.6 营养缺陷型筛选

3.2 结果

3.2.1 Prey蛋白及Bait蛋白克隆的构建

3.2.2 AcMNPV口服感染因子蛋白的酵母双杂交分析

3.3 讨论

3.4 小结

第4章总结与展望

4.1 AcMNPV P74第一次剪切位点是R319/R323/R325/R

4.2 AcMNPV十个口服感染因子间的相互作用

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张楠

导师: 王曼丽,胡志红

关键词: 杆状病毒,口服感染,剪切,相互作用

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)

分类号: Q939.4

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杆状病毒AcMNPV口服感染因子P74的剪切位点鉴定

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