海洋真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成相关功能基因的异源表达及初步敲除

论文摘要

深海海洋中有着丰富的微生物资源,尤其是深海真菌,能够产生大量新颖的、有较强生物学活性的次级代谢产物。由于独特的海洋生存环境,例如高温,高压,低营养以及弱光照,导致海洋真菌具有丰富的物种多样性,加上特殊的防御机制,能促进各种类型的次级代谢产物的生物合成。此外,已经报道过的新型海洋真菌次级代谢产物高达有1000多种,而且部分在抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化以及抗癌症等方面有较强的活性。胶霉毒素是烟曲霉合成的具有氧化还原性的非核糖体环肽,是一种含2个硫的有很强致病性的二酮哌嗪类化合物（ETPs）。胶霉毒素能破坏细胞内氧化还原平衡,产生活性氧等有害物质。其在抗肿瘤、抗真菌、抗氧化以及作为医疗诊断试剂方面具有良好的开发前景。本课题组前期已从深海真菌Geosmithia pallida FS140中分离出了大量具有抗真菌及抗肿瘤活性的胶霉毒素及其衍生物,其中有大量结构新颖的胶霉毒素类二聚体化合物,提示该真菌可能存在独特的胶霉毒素生物合成基因簇。本论文对分离自南海深海沉积物的真菌曲霉Geosmithia pallida FS140中胶霉毒素生物合成关键基因gliT和gliM2进行了异源表达纯化和酶学性质分析,硫氧还蛋白还原酶的最适酶促反应温度40℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在30℃时最好;甲基转移酶的最适反应温度为35℃,最佳酶促反应pH为pH7.0,热稳定性在35℃时最好,为后续其在生产实践中应用奠定了基础。对gliF基因进行了在酵母细胞中的成功克隆,构建了含gliF基因的pPIC9k表达载体,并对其进行了成功的表达纯化,为后续继续研究其酶学性质提供了有力条件。并且对功能基因gliT和gliF进行了CRISPR-Cas9系统的构建,优化了深海真菌原生质体的制备方法和转化方法,为后续深海真菌Geosmithia pallida FS140胶霉毒素生物合成功能基因和代谢通路的研究奠定了分子生物学基础。综上所述,本研究从深海真菌中筛选出胶霉毒素生物合成关键基因gliT、gliM2和gliF,并对其进行了体外克隆、异源表达、分离纯化与酶活分析,为进一步研究深海真菌Geosmithia pallida FS140的硫氧还蛋白还原酶、氧甲基转移酶和细胞色素氧化酶的生物学功能及更好地将深海真菌Geosmithia pallida FS140应用于工业生产提供参考依据。并且,构建出适用于深海丝状真菌的CRISPR-Cas9敲除系统和原生质体制备系统,为深海丝状真菌更多功能基因的挖掘以及分离新型活性次级代谢产物骨架奠定分子生物学基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

绪论

1 深海真菌的研究概况

1.1 深海真菌的生活环境概况

1.2 海洋真菌多样性及其次级代谢产物的类型与生物活性

1.3 海洋真菌功能基因发掘与研究方法

2 胶霉毒素的研究概况

2.1 胶霉毒素简介

2.2 胶霉毒素生物合成过程及调控机制

2.3 胶霉毒素的作用机制

2.3.1 胶霉毒素在细胞凋亡中的诱导机制

2.3.2 胶霉毒素在宿主细胞中的免疫抑制效应机制

2.3.3 胶霉毒素在感染疾病中的作用机制

2.4 胶霉毒素的潜在应用价值

3 课题研究的目的及意义

第一章硫氧还蛋白还原酶gliT的克隆表达及酶活分析

1 主要实验材料与器材

1.1 试剂与材料

1.2 主要仪器

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 gliT基因片段的获得

2.3 目的基因gliT的克隆

2.4 目的基因gliT的小量诱导表达

2.5 SDS-PAGE电泳分析检测和Western-blot验证

2.6 目的基因gliT的大量表达及纯化

2.7 目的蛋白的质谱鉴定

2.7.1 蛋白酶切

2.7.2 肽段抽提

2.7.3 点靶

2.7.4 质谱检测

2.8 硫氧还蛋白还原酶的酶学性质分析

2.8.1 酶促反应

2.8.2 最佳酶促反应温度的确定

2.8.3 最佳酶促反应pH的确定

2.8.4 酶的热稳定性分析

2.8.5 酶的动力学常数

3 实验结果

3.1 gliT基因片段的获得

3.2 目的基因gliT的克隆

3.3 目的蛋白的表达产物SDS-PAGE检测与Western-blot分析

3.4 目的蛋白的纯化复性

3.5 质谱鉴定结果与分析

3.6 目的蛋白的酶学性质分析

3.6.1 酶促反应

3.6.2 最佳酶促反应温度的确定

3.6.3 最佳酶促反应pH的确定

3.6.4 硫氧还蛋白还原酶的热稳定性

3.6.5 硫氧还蛋白还原酶的热力学常数

4 讨论与小结

第二章甲基转移酶gliM2 的克隆表达及酶活分析

1 主要实验材料与器材

1.1 试剂与材料

1.2 实验器材

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 甲基转移酶基因gliM2 片段的扩增

2.3 甲基转移酶基因gliM2 的克隆

2.4 甲基转移酶基因gliM2 的诱导表达

2.5 SDS-PAGE电泳分析检测和Western-blot验证

2.6 甲基转移酶gliM2 的纯化

2.7 甲基转移酶gliM2 的酶学性质分析

2.7.1 酶促反应

2.7.2 最适温度的确定

2.7.3 最适pH的确定

2.7.4 酶的热稳定性分析

3 实验结果

3.1 甲基转移酶gliM2 片段的获得

3.2 甲基转移酶gliM2 表达载体的构建

3.3 甲基转移酶的诱导表达

3.4 甲基转移酶的纯化脱盐及Western-blot分析

3.5 甲基转移酶gliM2 的酶学性质分析

3.5.1 酶促反应

3.5.2 最佳酶促反应温度的确定

3.5.3 最佳酶促反应pH的确定

3.5.4 甲基转移酶的热稳定性

4 讨论与小结

第三章细胞色素氧化酶gliF在酵母细胞中的克隆表达

1 主要实验材料与试剂

1.1 试剂与材料

1.2 实验器材

1.3 培养基配方

2 实验方法

2.1 引物设计

2.2 细胞色素氧化酶gliF基因的获得

2.3 pPIC9k-gliF重组质粒的构建

2.4 KM71 酵母感受态的制备

2.5 单酶切重组质粒并回收

2.6 重组质粒的电转化

2.7 酵母基因组的提取及PCR的鉴定

2.8 pPIC9k-gliF的诱导表达

3 实验结果

3.1 细胞色素氧化酶gliF基因的成功获得

3.2 pPIC9k-gliF重组质粒的成功构建

3.3 酵母基因组的成功提取及PCR的鉴定

3.4 pPIC9K-gliF重组蛋白的诱导表达及纯化

4 讨论与小结

第四章深海真菌Geosmithia pallida FS140 胶霉毒素生物合成基因gliT和 gliF敲除系统的构建

1 实验材料

1.1 材料与试剂

1.2 实验器材

2 实验方法

2.1 深海真菌Geosmithia pallida FS140 原生质体的制备

2.2 深海真菌Geosmithia pallida FS140 抗生素的筛选和优化

2.3 CRISPR-Cas9 敲除载体的构建

2.4 CRISPR-Cas9 敲除载体转化原生质体的方法优化

3 实验结果

3.1 深海真菌Geosmithia pallida FS140 原生质体的成功制备

3.2 深海真菌Geosmithia pallida FS140 对于4 种抗生素最适的筛选浓度

3.3 CRISPR-Cas9 敲除载体的成功构建

3.4 重组敲除载体导入Geosmithia pallida FS140 原生质体

4 讨论与小结

总结与展望

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘帅

导师: 杨云龙,章卫民

关键词: 海洋真菌,胶霉毒素,克隆表达

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建农林大学

分类号: Q936

总页数: 77

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