酪氨酸酚裂解酶改造强化全细胞催化合成左旋多巴

论文摘要

左旋多巴（3,4-2dihydroxylphenylalanine,L-DOPA）是治疗帕金森综合症的主要药物,随着我国人口老龄化速度的加快,对左旋多巴的需求也迅速增加。目前应用于工业化生产L-DOPA的方法主有化学合成和微生物酶催化法。化学合成法虽然具有纯度高和收率高的优势,但也存在步骤繁杂、环境污染严重、成本较高等问题;微生物酶催化法具有工艺简单、产量稳定、条件温和等优点,具有广阔的工业化应用前景。原始菌株（如Erwinia herbicola等）中的酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine phenol-lyase,TPL）活性普遍较低,无法直接用于高效催化合成L-DOPA。为了提高酪氨酸酚裂解酶表达量与酶活,本研究在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达来源于草生欧文式菌（Erwinia herbicola）的TPL,通过易错PCR技术对酪氨酸酚裂解酶基因进行定向进化,并分别在摇瓶和5 L发酵罐水平上对重组菌的培养条件以及催化合成L-DOPA的条件进行了优化,提高了酪氨酸酚裂解酶的催化效率和L-DOPA的产量。论文主要研究结果如下:（1）结合易错PCR和高通量筛选技术定向进化酪氨酸酚裂解酶,强化TPL催化活性,并分析突变体酶学性质。首先对易错PCR的条件进行了优化,确定了Mg2+和Mn2+的最适添加浓度,平均突变率为0.5%。经两轮易错PCR和高通量筛选,从大约2×104个突变体中筛选获得了一株正向突变株3-2F9。经全细胞催化,L-DOPA产量较原始菌株提高了36.5%。通过测定突变TPL的酶学性质,得到其最适反应温度为30oC,最适pH为9.0。在温度20-35oC以及pH8.5-10.0之间时,酶的稳定性较好。（2）在摇瓶水平上对突变菌株的培养条件、发酵产酶条件及L-DOPA合成条件进行优化。通过对培养基的优化确定了最适培养基成份为:以TB培养基为基础,添加1.5 g·L-1的MgSO4·7H2O和4 mL·L-1的TES。最适发酵条件为:种子最适培养时间为8-10 h,随后添加0.2 mmol·L-1的IPTG在25oC诱导培养12 h。最适转化条件为:底物丙酮酸钠、邻苯二酚和乙酸铵的初始浓度分别为15 g·L-1、10 g·L-1和30 g·L-1,每隔1.5 h分别补加丙酮酸钠和邻苯二酚至终浓度为6 g·L-1和4 g·L-1,共补料三次。在最适条件下,15oC反应8 h后,L-DOPA产量最高可达30 g·L-1,较优化前提高了72.4%。（3）在5 L发酵罐上对重组菌E.coli BL21高密度发酵生产TPL及催化合成L-DOPA的条件进行优化。确定了最适接种量为2%,采用DO-stat补料策略,建立了三阶段控制溶氧的发酵培养模式。具体的补料分批发酵工艺为:诱导前控制溶氧浓度为20%,诱导后前2 h控制溶氧为30%,之后控制溶氧在40%以上,流加甘油浓度为300 g·L-1。确定了罐上催化反应连续流加底物方法为:丙酮酸钠12g·L-1·h-1,邻苯二酚在前2 h、2-4 h、和4-5 h流加速率分别为10 g·L-1·h-1、7 g·L-1·h-1和4 g·L-1·h-1。在该条件下,TPL酶活在发酵10 h可达到2.4 U·mL-1,菌体浓度达到51.2,L-DOPA产量为69.1 g·L-1。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 左旋多巴

1.1.1 左旋多巴的概述

1.1.2 左旋多巴的合成

1.2 酪氨酸酚裂解酶

1.2.1 酪氨酸酚裂解酶简介

1.2.2 酪氨酸酚裂解酶催化机理

1.2.3 酪氨酸酚裂解酶的应用现状

1.3 立题依据与研究内容

1.3.1 立题依据

1.3.2 研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要溶液

2.1.5 主要仪器

2.2 分子生物学操作

2.2.1 易错PCR

2.2.2 PCR产物的纯化回收

2.2.3 突变PCR产物的连接与重组质粒的转化

2.2.4 阳性转化子的鉴定

2.3 培养方法

2.3.1 菌种培养及全细胞催化剂的制备

2.3.2 全细胞催化合成L-DOPA

2.3.3 重组大肠杆菌培养条件优化

2.3.4 重组大肠杆菌诱导条件优化

2.3.5 全细胞催化条件优化

2.4 纯化与分析方法

2.4.1 酶的纯化

2.4.2 蛋白浓度及酶活测定

2.4.3 TPL酶学性质的测定

2.4.4 菌体浓度测定

2.4.5 L-DOPA液相检测方法

2.4.6 甘油检测方法

2.4.7 高通量筛选方法

第三章结果与讨论

3.1 易错PCR反应体系建立及TPL基因突变库的构建

3.1.1 易错PCR条件的优化

3.1.2 TPL基因突变体库的构建与筛选

3.1.3 突变TPL（突变株3-2F9）的表达与纯化

3.1.4 突变酶的最适温度和温度稳定性

3.1.5 突变酶的最适pH和 pH稳定性

3.1.6 突变酶的动力学参数测定及突变位点分析

3.2 摇瓶水平上发酵生产TPL及催化合成L-DOPA的条件优化

3.2.1 重组E.coli BL21 的培养条件优化

3.2.2 重组E.coli BL21 产酶条件优化

3.2.3 L-DOPA合成条件的优化

3.3 重组大肠杆菌在5 L罐上生产L-DOPA的高密度发酵研究

3.3.1 重组大肠杆菌的分批发酵

3.3.2 搅拌转速对酪氨酸酚裂解酶分批发酵的影响

3.3.3 DO-Stat流加控制培养

3.3.4 诱导起始时间的优化

3.3.5 底物流加方式的优化

结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐冰冰

导师: 周景文

关键词: 左旋多巴,酪氨酸酚裂解酶,易错,发酵优化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ460.1;TQ920.6

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