刘宇[1]2003年在《低分子量羊胎免疫调节因子质量标准的初步研究》文中认为本课题围绕3000Da以下低分子量羊胎免疫调节因子(goat embryo immunoregulatory factor，GEIF)的质量标准进行了初步的研究，着重对其指纹图谱指标进行色谱条件的确定和方法的建立，并在此基础上对主要成分峰及其稳定性进行了初步分析。 1、原料羊胎标准：根据山羊各期特征的比较确定了二月龄左右的山羊胚胎，胎长为5.0-10.0cm，胎重8-40g，头长1.5-3cm，颈长0.5-2.0cm，尾长1-2.5cm，前肢长1.5-3cm，耳廓长0.2-0.5cm。 2、主要工艺标准：通过初步比较透析和超滤工艺，选择获取成分较多且活性相对较高的超滤作为主要工艺。 3、鉴别和检查指标标准：通过理化性质、紫外光谱、分子量指标、指纹图谱、水解氨基酸指标五部分进行确定。 (1)理化性质指标：按照《中华人民共和国药典》(2000版)附录和《生物制品规程》(2000版)所载方法对连续10批低分子量羊胎免疫调节因子的颜色、澄明度、pH值、多肽含量及核酸含量、蛋白定性反应进行鉴定。 结果表明：低分子量羊胎免疫调节因子为微黄色澄明液体，具有可透析性，可超滤性：pH值位于6.5～7.0之间；其中所含多肽含量＞600ug／ml；核酸含量＞600ug／ml；蛋白质定性反应确定低分子量羊胎免疫调节因子呈现蛋白阴性特征。 (2)紫外光谱指标：在230nm～330nm之间作紫外扫描分析，发现10批次低分子量羊胎免疫调节因子的特征吸收峰均在251±2nm处，而且A_(260nm)／A_(280nm)＞2.0。 (3)分子量指标：利用凝胶色谱法确定低分子量羊胎免疫调节因子分子量范围，10批次低分子量羊胎免疫调节因子中均检测不到3000Da以上的物质。 (4)指纹图谱指标：通过反相高效液相色谱(Reversed-Phase High-performance Liquid Chromatography，RP-HPLC)多种参数的比较，探讨 理学硕士学位论文：低分子公羊胎免疫调节因子质量标准的初步研究了流动相、梯度、流速、温度、波长各种条件对未知混合成分分离的影响，建立了最佳色谱测定方法；并对连续10批样品进行指纹图谱分析；在此前提下，对主要成分峰进行进一步分析：用二极管阵列检测器检测到各峰不同时间段的光谱扫描图，同时结合部叁酮反应的结果，对各主要成分峰的纯度和性质作了初步判断；另外，通过指纹图谱，初步分析温度及放置时间对样品稳定性的影响。 获得的 17个主要成分峰中，其中大于总面积 5％的峰有 7个，方法精密度实验说明各峰保留时间的相对标准偏差均可控制在0．3％以下，峰面积和峰高则在5．0％和生0％以内：并且10批次样品指纹图谱相似度都与1接近；进一步的主要成分峰分析发现17个分高峰中有8个是纯峰，其中可初步辨别8种成分为多肽类，9种为核酸类；稳定性研究发现七0oC及20eC下放置2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时的样品在相同色谱条件下指纹图谱相似度均高于0．995，出峰没有显着变化。 ，（5）水解氨基酸指标：利用氨基酸自动分析仪对水解氨基酸进行分析，证实了低分子量羊胎免疫调节因子中含十七种水解氨基酸。 4、免疫活性试验：通过活E玫瑰花结和淋巴转化实验初步验证了低分子量羊胎免疫调节因子具有细胞免疫调节功能。 5、安全性标准：选择无菌试验、过敏试验、异常毒性试验和热原质反应对其进行评价，说明低分子量羊胎免疫调节因子对实验动物并无任何毒副作用，。 综上所述，通过原料、工艺的选择和一系列定性定量指标的确定，为制定完整低分子量羊胎免疫调节因子的质量标准提供了必要的实验数据；同时建立了控制质量标准较精确的定性定量指标——指纹图谱，也能为类似动物生化药物提供质量控制的方法学参考：另外，实验显示出低分子量羊胎免疫调节因子是安全、有效、可控的，为其开发为一种新型生物制品提供了必要的依据。
任兴宏[2]2010年在《羊胎盘免疫活性小分子肽的分离纯化》文中认为胎盘是哺乳类胎生动物在妊娠时为胎儿供应养分,供胚胎生长的特殊器官。其组织细胞内含有丰富的类固醇激素,肽类激素,前列腺素,生长因子,细胞因子等胎儿生长所需的物质成分。自从1943年日本京都医院山岛教授从羊胎盘中成功地提取出羊胎素后,对羊胎盘提取液的研究引起了广大学者的浓厚兴趣。近年来研究发现,羊胎盘提取液中富含包括小分子肽类的多种生物活性物质。但是对羊胎盘提取液中功能组分的纯化、功能组分的组成研究的相关报道甚少。本研究采用组织匀浆、反复冻融、冷冻离心、超滤的方法制备羊胎盘提取液；采用加脲的Tricine-SDS-PAGE电泳初步鉴定胎盘肽的存在；采用RP-HPLC逐级分离、纯化羊胎盘提取液肽组分,并采用E-玫瑰花环试验检测各肽组分的免疫活性；用Edman降解法测活性组分N末端氨基酸序列。其目的是通过超滤和反相高效液相色谱将结合的方法分离纯化出有免疫活性的胎盘肽,并对所纯化的羊胎盘肽的免疫活性进行分析和氨基酸序列鉴定,为进一步阐明其生物活性的作用机理和免疫活性小分子肽的进一步研发提供必要的依据。本实验的研究内容如下：1、采用组织匀浆、反复冻融和超滤相结合的方法制备羊胎盘提取液。2、对所制备的羊胎盘提取液进行理化性质鉴定,并采用Tricine-SDS-PAGE电泳方法鉴定羊胎盘肽是否存在。3、采用RP-HPLC方法对所制备的羊胎盘提取液逐一纯化得到纯度比较高的单一组分,并采用E-玫瑰花环实验对各个纯化物进行免疫活性检测。4、对免疫活性高且纯度较高的组分,采用Edman降解法测定N端氨基酸序列。实验结果：1、羊胎盘提取液均为无色或微黄色的透明液体,冷冻干燥后呈疏松多孔的海绵状白色粉末,其PH为6.40±0.02,蛋白质定性反应检测中颜色均变成紫红色,沉淀反应中蛋白质反应呈阴性,电泳结果显示羊胎盘提取液中含有小分子肽类物质,多肽含量为2.14±0.05mg/ml,在190-340nm范围内分别在212nm和253nm附近有两个吸收峰。2、RP-HPLC纯化出3个纯度较高的组分,分别为峰1-5、峰1-7、峰2-3,其纯度分别达到90.6%、91.4%、99.6%。3、通过E-玫瑰花环实验对3个纯度较高组分的活性测定表明峰1-5、峰2-3有免疫活性。Edman降解法测得峰2-3的N端的前10个氨基酸序列为：Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,将该段氨基酸序列登录美国国立生物技术信息中心,应用BLAST检索工具进行短序列匹配的蛋白质数据库检索,发现没有与此多肽同源的序列,为一新的多肽。该多肽的免疫功能稳定性及其作用机制尚需要进一步的研究。结论：(1)采用反复冻融结合超滤方法获得PH6.40±0.02、多肽含量为2.14±0.05mg/ml羊胎盘提取液。(2)利用RP-HPLC逐级分离纯化羊胎盘提取液,纯化峰1-5、峰1-7、峰2-3叁个肽组分,其肽纯度分别为90.6%、91.4%、99.6%。E-玫瑰花环试验检测发现峰1-5、峰2-3组分具有增强脱受体的淋巴细胞恢复其表面受体的功能,促进人外周血T淋巴细胞E玫瑰花环形成,并具有剂量效应依赖关系,表明两个纯化组分具有T细胞免疫活性。(3) Edman降解法测定峰2-3组分的氨基酸测序,发现N端前十个氨基酸序列为Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,经Blast蛋白质数据库检索发现该多肽为一个新的多肽。
参考文献：
[1]. 低分子量羊胎免疫调节因子质量标准的初步研究[D]. 刘宇. 西南师范大学. 2003
[2]. 羊胎盘免疫活性小分子肽的分离纯化[D]. 任兴宏. 西南大学. 2010