李秀娟[1]2003年在《一氧化氮、氧自由基及细胞凋亡与形觉剥夺性近视》文中提出高度近视亦称病理性近视或变性近视，约占原发性近视的3％～6％。患者的视力严重下降，矫正视力多不理想，这极大的影响了患者的学习、工作和生活。人们对近视的研究已有200多年的历史，但其发病机制至今不明。形觉剥夺学说认为：一些在发育早期影响视网膜上正常成像的因素可导致眼轴过度增长，形成高度近视。自1977年首次建立形觉剥夺性近视(form-deprivation myopia，FDM)动物模型以来，高度近视的基础研究取得了突破性进展，人们对其发生、发展有了进一步了解。目前已知视网膜上多种神经递质及生物活性物质参与了出生后眼球生长的调控，促进形觉剥夺性近视的形成。近年的研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一类新发现的神经递质参与了形觉剥夺性近视的形成，但其具体作用机制不详。有研究发现，鸡眼形觉剥夺时，视网膜-色素上皮-脉络膜中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低，形觉剥夺性近视形成过程中是否存在有氧自由基聚集，脂质过氧化的现象，目前尚不清楚。有资料显示，病理性近视眼视网膜中存在感光细胞凋亡的现象，形觉剥夺性近视形成过程中是否存在视网膜细胞凋亡的现象，尚未见相关报道。本研究拟建立新生鸡形觉剥夺性近视模型，应用化学比色法测定视网膜-色素上皮-脉络膜中一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)、SOD的活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，应用HE染色观察视网膜和巩膜的形态学改变，采用TUNEL技术检测视网膜细胞凋亡的情况，从而探讨形觉剥夺性近视的发生机制，NO、氧自由基及细胞凋亡与形觉剥夺性近视形成的关系。 材料与方法郑州大学2003年硕士毕业论文一氧化氮、氧自由基及细胞凋亡一与形觉剥夺性近视1.生化方面的检测:选用健康雄性海兰雏鸡80只，随机分为4组，出生后第二天将右眼以半透明眼罩遮盖作为形觉遮盖眼，左眼为开放对照眼。分别于遮盖7、14、21、28天时去除眼罩，自然状态下检影验光，确定遮盖眼及对照眼的屈光状态，而后迅速断颈处死，摘出眼球，剪除眼球周围软组织，用游标卡尺测其眼轴长及赤道径。解剖显微镜下于冰台上剥离视网膜一色素上皮一脉络膜、匀浆、高速冷冻离心机离心20分钟(0一2℃，3500甲m)，上清液即为待测样本。化学比色法测定视网膜一色素上皮一脉络膜中NOS、SOD的活性及MDA的含量。2.形态学观察及TIJNEL染色:选用健康雄性海兰雏鸡加只，半透明眼罩遮盖右眼，遮盖眼于遮盖7天时去除眼罩，自然状态下检影验光，而后迅速断颈处死，摘出眼球，剪除眼球周围软组织，用游标卡尺测其眼轴长及赤道径。常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，作spm厚石蜡切片。常规HE染色，于光学显微镜下观察视网膜及巩膜的形态学变化;采用Tl」NEL技术，检测视网膜细胞凋亡的情况。结果1.生化方面的检测:(1)眼罩遮盖使遮盖眼形成近视:遮盖眼负性屈光度、眼轴长及赤道径增长迅速，同一时间点遮盖眼与对照眼屈光度、眼轴长及赤道径相比差异有显着性(p<。.05)，随遮盖时间延长双眼间差异更显着。(2)i一05活性(U/m 9 prot)=遮盖7、14、21、28天时，遮盖眼视网膜一色素上皮一脉络膜中i一NOS活性分别为0.35士0.02、0.33士0.02、0.32士0.02、0.29士0.02，对照眼中分别为0.39士0.02、0.37士0.03、0.39士0.02、0.37士0.03;同一时间点与对照眼相比，遮盖眼视网膜-色素上皮一脉络膜中i一05活性降低，双眼相比差异有显着性争<0.05)，随着遮盖时间的延长，遮盖眼中i一NOS活性不断降低，双眼间的差异更显着。(3)总NOS活性:遮盖眼与对照眼视网膜一色素上皮一脉络膜中总NOS活性相比差异无显着性幼>0.05)。(4)MDA含量(nmol/mg prot):在遮盖7、14、21、28天时，遮盖眼视网膜一色素上皮一脉络膜中MDA含量分别为1 .52士0.29、1.64士0.21、1.97士0.22、1.93士0.27，对照眼中分别为1.30士0.22、1.26士0.27、1.37士0.28、1 .51士0.28，同一时间点，遮盖眼视网膜一色素上皮一脉络膜中MDA的含量均高于对照眼，双眼相比差异有显着性(尸<0.05)。(5)soD活性(NU/mg prot):在遮盖7、14、21、28天时，遮盖眼视网膜一色素上皮一脉络膜中SOD的活性分别为令郑州大学2003年硕士毕业论文一氧化氮、氧自由基及细胞凋亡与形觉剥夺性近视40.47士3.62、33.14士3.27、33.26士3.17、31.10士3.68，对照眼中分别为48.81士6.05、45.18士5.82、46.25士5.87、42.23士6.48，在同一时间点，遮盖眼视网膜一色素上皮一脉络膜中SOD活性均低于对照眼，双眼相比差异具有显着性(p<0.05)。2.形态学观察及Tl」NEL染色:(l)遮盖眼形成近视:遮盖眼与对照眼屈光度、眼轴长及赤道径差异有显着性(p<0.05)。(2) HE染色:遮盖眼视网膜较对照眼普遍变薄，尤以内核层、内丛状层、神经纤维层最为明显，且内核层胞核的层数较对照眼减少;遮盖眼后极部巩膜软骨层变厚，软骨细胞数增多，纤维层变薄。 (3) TUNEL染色:凋亡细胞的特征为细胞核中有紫蓝色颗粒，它主要分布于视网膜的感光细胞层、内核层、神经节细胞层。视网膜每油镜视野平均凋亡细胞数在对照
孔晓路[2]2009年在《高度近视阻止糖尿病视网膜病变发生的机制研究》文中进行了进一步梳理糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者的严重并发症之一,是导致失明的重要原因,但DR的发病机制仍在探讨中。临床发现高度近视患者即使有较长的糖尿病病史,也常常不伴有DR的发生;而且在同一糖尿病患者屈光参差的双眼中,近视程度较高眼的DR病变程度比对侧眼明显较轻。国内外已有的研究表明,近视的严重程度与DR的严重程度呈负相关,但缺乏相应的实验学依据。因此,进行高度近视对DR的阻滞机制研究对DR的发病机制及治疗有着重要的意义。由于视网膜小动脉无交感神经支配,因此血管内皮细胞通过释放NO松弛血管平滑肌,同时释放ET-1收缩血管,NO和ET-1的协调平衡维持着血管的外周阻力和局部血管的舒缩状态,协调着视网膜的血液循环,对DR的发生发展起着越来越重要的作用。本实验拟建立糖尿病联合高度近视眼动物模型,应用免疫组化法测定视网膜脉络膜中ET-1、iNOS蛋白含量及细胞凋亡的表达,初步探讨高度近视对糖尿病视网膜病变阻滞的机制。材料和方法选用出生3天的健康叁色豚鼠60只,体重100～130 g,雌雄不限,所有豚鼠排除先天性近视及其它眼疾,将豚鼠随机分为4组,Ⅰ组(对照组)15只,饲养6周后腹腔注射等量空白缓冲液;Ⅱ组(拟建高度近视眼动物模型组)15只,以半透明眼罩行右眼遮盖6周后,腹腔注射等量空白缓冲液;Ⅲ组(拟建糖尿病动物模型)15只,饲养6周后按60mg/kg剂量连续3周左下腹腔小剂量多次注射链脲佐菌(streptozocin,STZ)诱发糖尿病;Ⅳ组(拟建糖尿病合并高度近视眼动物模型组)15只,半透明眼罩遮盖右眼6周后按60mg/kg剂量连续3周左下腹腔小剂量多次注射STZ诱发糖尿病。各组豚鼠右眼结膜囊内滴1%复方托吡咔胺滴眼液3次,间隔10min,带状光检影,以屈光度＞-6.00D者为高度近视眼豚鼠模型,腹腔注射STZ3天后,凡空腹血糖≥16.7mmol/L~(-1)及尿糖阳性的豚鼠定为糖尿病豚鼠模型。饲养18周后检测4组豚鼠的体重、空腹血糖、双眼屈光度及眼轴长度,取眼球行视网膜切片HE染色、免疫组织化学染色及TUNEL染色,通过与电脑相连的Biosens Digital Imaging system V1.6高清晰度彩色病理图文分析系统作细胞ET-1蛋白、iNOS蛋白表达的半定量分析,用平均光密度值来表示免疫反应表达程度。结果1.体重及空腹血糖变化比较:正常对照组(Ⅰ组)和高度近视眼组(Ⅱ组)体重明显高于糖尿病组(Ⅲ组)及糖尿病合并高度近视眼组(Ⅳ组),其差异具有统计学意义(P＜0.05);Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅲ组与Ⅳ组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。Ⅲ组与Ⅳ组空腹血糖明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,其差异具有统计学意义(P＜0.05),Ⅲ组与Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅱ组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。2.屈光度及眼轴长变化比较:高度近视眼组(Ⅱ组)和糖尿病合并高度近视眼组(Ⅳ组)屈光度明显高于正常对照组(Ⅰ组)及糖尿病组(Ⅲ组),其差异具有统计学意义(P＜0.05);Ⅰ组和Ⅳ组、Ⅰ组及Ⅲ组相比无统计学意义(P＞0.05)。Ⅱ组和Ⅳ组眼轴长明显高于Ⅰ组及Ⅲ组,其差异具有统计学意义(P＜0.05),Ⅱ组与Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅲ组相比无统计学意义(P＞0.05)。3.免疫组化染色:ET-1、iNOS蛋白阳性细胞主要表达于神经节细胞层胞浆和内外丛状层,胞浆着色呈棕黄色。ET-1蛋白的表达:Ⅲ组及Ⅳ组阳性表达高于Ⅰ组及Ⅱ组,差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅲ组阳性表达高于Ⅳ组,但差异无统计学意义(P＞0.05);Ⅰ组及Ⅱ组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。iNOS蛋白的表达:Ⅲ组及Ⅳ组阳性表达高于Ⅰ组及Ⅱ组,差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅲ组阳性表达高于Ⅳ组,差异有统计学意义(P＜0.05);Ⅱ组阳性表达低于Ⅰ组,差异有统计学意义(P＜0.05)。4.TUNEL染色:荧光显微镜下凋亡细胞呈橙色荧光。正常组视网膜光感受器细胞极少见到凋亡,糖尿病组凋亡细胞明显增多。结论1.透明眼罩遮盖联合STZ小剂量多次腹腔注射是一种可靠的制备糖尿病合并高度近视眼动物模型的方法。2.ET-1/iNOS通过调节视网膜血流,参与了高度近视对DR发展的早期阻滞。3.糖尿病早期即出现了视网膜细胞凋亡。
参考文献：
[1]. 一氧化氮、氧自由基及细胞凋亡与形觉剥夺性近视[D]. 李秀娟. 郑州大学. 2003
[2]. 高度近视阻止糖尿病视网膜病变发生的机制研究[D]. 孔晓路. 郑州大学. 2009
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