导读:本文包含了蔗糖酶基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蔗糖,聚糖,基因,淀粉,芽孢,球菌,多糖。
蔗糖酶基因论文文献综述
徐君,张言周,黎循航,管政兵,蔡宇杰[1]（2019）在《果聚糖蔗糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析》一文中研究指出将来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因进行克隆,并将其在Escherichia coli BL21(DE3)中表达。对发酵产酶后的菌体进行破壁和离心,粗酶液经镍柱纯化后,进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的水解酶活和转移酶活最适温度分别为45℃和40℃,最适pH分别为6.5和6.0。此外,果聚糖蔗糖酶的K_m和V_(max)分别为150.74mmol/L和21.23μmol/(mL·min)。最后,在pH 6.0、40℃条件下,果聚糖蔗糖酶催化反应12 h后,体系中果聚糖质量分数可达34.05%。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2019年03期）
许本宏,林俊芳,郭丽琼,叶志伟,李娇娇[2]（2017）在《罗伊氏乳杆菌果聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达》一文中研究指出以罗伊氏乳杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得果聚糖蔗糖酶基因lev。生物信息学分析表明:该基因全长1 776 bp,编码一个含591个氨基酸残基的多肽。该多肽的预测分子质量为65.47 ku,等电点为4.74,二级结构主要有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成。克隆所得的lev基因与Gen Bank注册的罗伊氏乳杆菌lev基因(注册号:EF534264.1)的核苷酸序列同源性为97.97%。本研究所得lev基因经构建表达载体在大肠杆菌BL21中表达,重组酶具有果聚糖蔗糖酶的活性。(本文来源于《中国食品学报》期刊2017年02期）
徐君[3]（2016）在《Bacillus amyloliquefaciens H47果聚糖蔗糖酶基因的克隆、表达及其应用研究》一文中研究指出Levan果聚糖是果聚糖中的一类,广泛存在于许多植物和微生物中,在化学、医疗、化妆品和食品等产业有很大的应用潜力。Levan果聚糖在植物中含量偏低,提取成本较高,微生物发酵产levan果聚糖时,由于菌体生长会利用一部分底物,使levan果聚糖的产量普遍偏低,而通过果聚糖蔗糖酶酶法合成levan果聚糖较为易行,且合成后的levan果聚糖纯化方法较为简单。因此研究果聚糖蔗糖酶酶法合成levan果聚糖,具有一定的理论意义与与潜在的应用价值。论文以实验室从蜂蜜中筛选获得的一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为材料,克隆了其中的果聚糖蔗糖酶基因,并以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主实现了该酶的异源表达,纯化后分析了重组酶酶学性质,并对酶法合成levan果聚糖进行了初步探索。论文主要研究结果如下:1)通过全基因组测序和序列比对分析B.amyloliquefaciens H47中的果聚糖蔗糖酶基因,果聚糖蔗糖酶基因lsase长度为1422 bp,共编码473个氨基酸。经PCR扩增lsase片段,并构建重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-lsase。重组菌诱导表达后,SDS-PAGE显示重组果聚糖蔗糖酶分子量约为52 k Da。优化了重组酶的表达条件,确定最佳的诱导条件为:初始诱导菌浓OD600为0.6,IPTG浓度为0.4 mmol·L~(-1),温度为30℃,诱导时间12 h。在此条件下,果聚糖蔗糖酶的酶活为76.6 U·ml~(-1)。2)用Ni~(2+)亲和柱分离目的蛋白,纯化后的果聚糖蔗糖酶比酶活达到151.6 U·mg~(-1)。酶学性质分析显示重组酶分解酶活的最适温度为45℃,转移酶活最适温度为40℃,而最适p H分别为6.5和6.0。Fe3+和Mg~(2+)对该酶的分解酶活和转移酶活均有轻微的促进作用。此外,果聚糖蔗糖酶的Km和Vmax分别为150.7 mmol·L~(-1)和153.6 U·mg~(-1)。3)对果聚糖蔗糖酶催化合成的产物进行了单糖组分和红外光谱分析,结果表明由该重组酶催化蔗糖合成的产物为levan果聚糖。此外,蔗糖浓度是影响levan果聚糖分子量最重要的因素,在蔗糖浓度100和600 g·L~(-1)时,levan果聚糖的分子量分别为8.0和2.8 k Da,而温度和加酶量对其分子量的影响较小。4)研究了蔗糖浓度,加酶量,p H,反应温度等条件对合成levan的影响。结果表明:当蔗糖浓度300 g·L~(-1),LSase加酶量10 U·m L~(-1),p H 6.0,35℃条件下催化15 h,转化率达到最高,为38.8%。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
张磊[4]（2014）在《淀粉蔗糖酶基因定点突变及其酶学性质表征》一文中研究指出淀粉蔗糖酶（Amylosucrase简称AS）是一种新型的葡萄糖基转移酶，属于糖苷水解酶家族13（GH13），该酶在仅以蔗糖为底物时，能够催化合成仅由α-1,4糖苷键连接的葡聚糖聚合物，并在反应过程中释放出果糖。与大多数合成多糖的酶不同，AS在合成聚合物时仅利用了蔗糖中糖苷键断裂所释放的能量。在蔗糖参与下，AS还可以发生十分复杂的反应，包括水解反应、转糖基作用，聚合反应，AS会根据受体分子的不同合成不同产物，如直链淀粉类的多聚糖高聚物、寡糖，转糖基产物等。因此，AS将成为工业生产上一种简单，方便，有效的生物合成工具。本研究通过定点突变获得突变株，经SDS-PAGE检测，Western blot分析后进行酶学性质表征。试验结果如下：1.以晶体结构3UEQ为模板，通过Pymol软件作图分析，表明R292和F191位点分别与活性位点D294之间以氢键相连，运用ClustalX2软件进行多重序列比对，证明了R292位点与F191位点均属于相对保守序列。因此，本研究将对R292位点和F191位点进行定点突变。2.以多糖奈瑟球菌（ATCC43768）中编码的淀粉蔗糖酶基因为模板，利用Primer5.0进行定点突变引物的设计，分别突变成R292F、R292M、R292D、R292K和F191M。利用PCR仪进行定点突变，并在E.coli BL21中异源表达，经IPTG诱导和超声波破碎后进行纯化。3.突变株R292F、R292D、R292M、R292K和F191M的比酶活分别为154.84U/mg、108.39U/mg、144.84U/mg、181.06U/mg和202.38U/mg，是野生型的1.11倍、0.77倍、1.04倍、1.29倍和1.45倍。酶学性质表征显示，野生型的最适pH为7.0，而突变株R292D、R292F、R292M、R292K和F191M的最适pH分别为7.5、7.0、7.5、7.0和8.0；野生型的最适温度为35℃，突变株R292D、R292F、R292M、R292K和F191M的最适温度分别为35℃、35℃、37℃、32℃和35℃；热稳定性显示，野生型半衰期为20h，突变株R292D、R292F、R292M、R292K和F191M的半衰期分别为17h、21h、16h、21h和19h；金属离子及有机溶剂的试验显示，突变株在某些因素上相对于野生型具有较好的抗性。动力学研究表明，R292F、R292K和F191M的Vmax较野生型都明显的提高，分别为野生型的1.19、1.44和1.45倍，R292M与野生型基本相同，R292D略有下降。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2014-06-01）
李阳[5]（2014）在《菊粉内切酶和蔗糖酶基因的高效重组表达及其在水解菊粉中的应用》一文中研究指出菊粉酶(Inulinase)是一种呋喃果糖基水解酶，它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷键并将其水解为果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分为菊粉外切酶和菊粉内切酶。菊粉外切酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下β-D-呋喃果糖残基，其底物可为菊粉、蔗糖和果聚糖；菊粉内切酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键使其变成菊糖叁糖、菊糖四糖和菊糖五糖为主的菊粉寡糖。蔗糖酶(Invertase)是一种β-呋喃果糖苷酶，它可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、高等植物和许多动物细胞中。其中，酒精酵母的蔗糖酶已被深入研究，并广泛应用于食品和发酵工业。酒精酵母的蔗糖酶主要是由SUC2基因编码的。本研究首先将节杆菌属Arthrobacter sp. S37来源的菊粉内切酶基因EnIA在酵母菌解脂亚罗维亚中表达，并研究了重组菊粉内切酶的性质及水解菊粉的产物。将菊粉内切酶基因EnIA连接到表达质粒pINA1317上，在Yarrowia lipolytica Po1h中进行分泌表达。重组转化子1317-EnIA生产的重组菊粉内切酶的酶活力和比活力大小分别为16.7U/mL和93.4U/mg，表观分子量大小为78.9kDa。重组酶的最适pH值为4.0，在pH2.0-8.0范围内，重组酶可以保持较高的活性。在40℃以下，重组酶有很好的稳定性，其最适作用温度为50℃。Li+离子对重组酶活性有激活作用。重组菊粉内切酶水解菊粉的主要产物为菊粉二糖。当把重组菊粉内切酶和菊粉外切酶混合水解菊粉时，混合物的菊粉酶活力大于两者菊粉酶相加之和，表现出协同作用。本实验室保藏的一株高产酒精酵母Saccharomyces sp. W0菌株可以缓慢地糖化菊粉产生单糖，利用菊粉发酵生产少量的酒精。将菊粉内切酶基因EnIA在酒精酵母W0菌株中表达，提高W0菌株的菊粉酶活力和酒精产量。把菊粉内切酶基因EnIA连接到酒精酵母表达载体pMIDSC31（δ序列插入型）和pMIRSC31（rDNA序列插入型）上，整合到W0菌株的基因组DNA中。δ序列插入型重组转化子D5的菊粉酶活力高于rDNA序列插入型重组转化子R1。重组转化子D5的菊粉酶活力达8.6U/mL。在5-L发酵罐体系中，转化子D5以菊粉含量为30%（w/v）的培养基进行酒精发酵，酒精产量为13.6%（v/v,20℃）。转化子D5同步糖化生料菊芋粉，在1-L发酵体系中，酒精产量达10.1%（v/v,20℃）。W0菌株具有很低的菊粉酶活性，根据氨基酸序列的多重比对分析结果推测可能与蔗糖酶基因SUC2相关。蔗糖酶基因SUC2与酒精酵母具有菊粉酶活力可以发酵菊粉生产酒精之间的关系还鲜有报道。本研究将SUC2基因完全敲除并将原始SUC2基因在敲除菌株中超表达，根据敲除和超表达之后的实验结果解释蔗糖酶基因SUC2与W0菌株具有菊粉酶活性是否相关。蔗糖酶基因SUC2被敲除后，完全敲除菌株W4失去蔗糖酶和菊粉酶活力，不能在以蔗糖或菊粉为唯一碳源的培养基中正常生长，可以在以果糖为唯一碳源的培养基中生长。在敲除菌株W4中超表达蔗糖酶SUC2基因，超表达转化子SUC2-1的SUC2基因表达量为W0菌株的113.6倍，蔗糖酶和菊粉酶活力分别是W0菌株的2.53倍和6.60倍。SUC2基因超表达转化子水解菊粉的产物是单糖，可以利用30%（w/v）的菊粉发酵培养基生产13.4%（v/v,20℃）的酒精。在1-L发酵体系中，超表达转化子SUC2-1同步糖化生料菊芋粉的酒精产量达10.9%（v/v,20℃）。本实验首次证明W0菌株的SUC2基因与其胞外和胞内菊粉酶活性有关，也证明了在W0菌株中超表达蔗糖酶的技术也可应用到酒精发酵工业上。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2014-05-27）
韩丽娜[6]（2014）在《受条锈菌诱导的小麦碱性/中性蔗糖酶基因（Tα-A/N-Inv）的克隆及功能分析》一文中研究指出长久以来,植物病原真菌给农业生产带来重大的经济损失。由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.t irici)引起的小麦条锈病是我国小麦生产上的重要病害之一,给我国小麦的生产造成严重经济损失。小麦条锈病表现为分布广、传播快、危害面积大等特点。随着分子生物学的飞速发展,利用分子生物学技术研究小麦-条锈菌互作分子机制对防控小麦条锈病具有重要意义。其中,对小麦抗条锈病基因的克隆和功能分析,及过敏性细胞坏死、活性氧和系统获得性抗性等与抗病相关信号通路的深入研究,不仅提高了人们对小麦抗条锈病分子机制的认识,而且为选育抗锈新品种实现可持续防控条锈病提供了理论依据。本研究克隆获得Ta-A/N-Inv基因,该基因可能通过改变寄主细胞内活性氧水平进而参与小麦-条锈菌互作过程中的寄主抗病防御机制。主要结果如下:从已构建的小麦-条锈菌互作的小麦cDNA文库中筛选获得小麦碱性/中性蔗糖酶基因Ta-A/N-Inv,克隆获得该基因的全长,Ta-A/N-Inv全长1659bp。对小麦Ta-A/N-Inv编码的蛋白分析发现,该基因编码的蛋白由552个氨基酸组成,分子量为62.89kDa,等电点为6.1。对小麦Ta-A/N-Inv基因结构域分析,发现Ta-A/N-Inv包含一个类似6个发卡结构糖苷酶的结构域和一个糖基水解酶家族100结构域(GH 100),其中GH 100是碱性/中性蔗糖酶的保守结构域。系统进化树分析发现,小麦Ta-A/N-Inv与水稻、玉米、粟相关基因的亲缘关系较近。利用拟南芥原生质体瞬时表达融合蛋白的方法,研究发现Ta-A/N-Inv主要分布在细胞质中。利用酵母蔗糖酶突变体异源表达Ta-A/N-Inv,证明Ta-A/N-Inv具有蔗糖酶活性,对其最适pH测定,得到该蛋白最适pH为8.5,说明Ta-A/N-Inv编码碱性蔗糖酶。通过测定小麦中总碱性/中性蔗糖酶的活性,可以看出小麦中总碱性/中性蔗糖酶受条锈菌诱导,接种条锈菌小种条中31 一天后小麦中总碱性/中性蔗糖酶的活性有明显的升高,接种五天后是未接种的3倍。对Ta-A/N-Inv的表达特征分析,发现Ta-A/N-Inv作为参与基础代谢的酶在很多组织中都有表达,但在叶中表达量最高;非生物胁迫低温、伤处理后,Ta-A/N-Inv基因相对表达量在2hpt到6hpt下调但是12hpt后开始上调;激素处理后,Ta-A/N-Inv基因相对表达量发生较大波动,主要呈下调趋势;Ta-A/N-Inv受条锈菌诱导上调表达,且亲和组合中相对表达量上调明显。利用BMSV-VIGS技术在小麦-条锈菌互作体系中对Ta-A/N-Inv基因功能的研究,推测Ta-A/NV-Inv可能通过改变寄主细胞内活性氧平衡进而参与小麦-条锈菌互作过程中的寄主抗病防御机制。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2014-05-01）
张舟[7]（2014）在《明串珠菌乙酸激酶和葡聚糖蔗糖酶基因失活的研究》一文中研究指出明串珠菌（Leuconostoc）是腌菜、韩国泡菜和德国泡菜等发酵蔬菜中的优势菌株，也是美国FDA认可的GRAS菌，不生产内毒素，能分泌特异性胞外蛋白且没有降解蛋白活性，所以明串珠菌是表达外源蛋白的很好的候选菌，在食品工业中具有巨大的应用价值。本课题分别失活了明串珠菌的乙酸激酶基因ack和葡聚糖蔗糖酶基因dts，得到相应的基因失活菌株，再与出发菌株进行生理生化特性对比，从而研究碳代谢的变化规律，为基因工程育种奠定了基础。明串珠菌电转化的再现性差、效率稍低，因此本研究优化了电转化条件。以pCW4为载体，明串珠菌为受体菌，固定接菌量和氨苄浓度，优化了PBS溶液的pH、LiAc-DTT孵育时间、溶菌酶的量和孵育液中蔗糖浓度。利用MRS(含0.48μg/mL氨苄)培养明串珠菌(初始OD600为0.048)，OD600为0.5左右时收集菌体，用LiAc-DTT溶液(含100U/mL溶菌酶、0.5mol/L蔗糖)孵育20min，再用pH6.9的PBS洗涤和电转化，得到较高的转化率，为2.47×105CFU/μgDNA。为了揭示碳流和能量流在代谢网络中的走向，失活肠膜明串珠菌ack基因。运用PCR技术分别扩增ack的上、下游同源臂，构建具有四环素抗性标记的同源重组载体，导入到明串珠菌经两次交换，使肠膜明串珠菌的ack失活，并检测突变菌株与原始菌株的生理特性。PCR验证表明，突变菌株的扩增产物长度比原始菌株的大1200bp左右。与原始菌株相比，突变菌株的乙酸产量减少49.1%，乙醇产量增加8.3%，双乙酰产量减少16.3%。甘露醇在食品工业和医药工业中有广泛应用，肠膜明串珠菌可以转化蔗糖生产甘露醇、葡聚糖和其他产物。为了提高甘露醇的产量，本研究通过失活肠膜明串珠菌dts阻断了葡聚糖的合成途径并研究了dts失活对甘露醇生产的影响。本研究对编码葡聚糖蔗糖酶的基因dts进行了克隆和测序。利用重迭延伸技术将dts基因的上游和下游同源臂连接在一起，再连接到pUC19上，获得同源重组载体pUC19-dts。将其导入肠膜明串珠菌，经过双交换，失活肠膜明串珠菌的dts基因，获得了不含抗性标记的dts失活菌株。发酵实验检测结果显示突变菌株的葡聚糖产量降低28.8%，甘露醇产量提高15.3%。(本文来源于《河北工业大学》期刊2014-05-01）
于慧[8]（2013）在《利用RNAi技术抑制褐飞虱蔗糖酶基因和蔗糖转运子基因的研究》一文中研究指出褐飞虱(Nilaparvata lugens (Stal))属同翅目(Homoptera)飞虱科(Dekphacidae),是我国及许多亚洲国家稻区的主要害虫。目前,防治褐飞虱的主要方法是化学防治。但是,长时间使用化学农药带来了农药残留,环境污染和害虫产生抗药性等问题。RNA干扰(RNA interference, RNAi)近年来迅速发展,广泛应用于基因功能确定、基因敲除、抗癌症和病毒病药物研究等方面的研究,也为病虫害防治提供了一个新的方向。本论文选取了4个褐飞虱生理活动相关基因作为靶标基因。基于RNAi技术构建了RNA干扰载体并转化水稻,获得了4种能分别表达各自靶标dsRNA的转基因植株。其中,2个靶标基因是褐飞虱蔗糖酶基因(命名为145、282),2个是蔗糖转运子基因(命名为303、246)。本论文采用玉米泛素启动子(Zea may polyubiquitin-1promoter, ZmUbi)指导dsRNA表达,用抗草甘膦基因G10evo(5-烯酮式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶,EPSPS)作为筛选标记,构建dsRNA的表达载体。利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化的方法将表达载体分别转化粳稻品种“秀水134”,获得了表达各自靶标基因dsRNA的抗草甘膦转基因水稻。在T0代转基因植株(145基因17株、282基因15株、303基因15株、246基因13株)的褐飞虱生物活性测定中,实验组褐飞虱数量与对照组并没有明显差异。虽然虫体死亡或数量减少,但大多为接虫时的机械损伤或褐飞虱逃逸所致,转基因植株相较对照组并没有表现出褐飞虱抗性。在T0代145、282、303、246转基因植株中,每个基因选取7个株系的种子进行发芽,并在水稻5叶期喷施200倍的草甘膦筛选阳性转基因植株。用Northern Blot的方法对阳性植株的dsRNA表达情况进行检测,结果表明每个基因中均有dsRNA表达量较高的株系存在(145基因为4、7号,282基因为1、3、7号,303基因为4、6号,246基因为2、5、7号)。根据Northern Blot的结果,每个基因选取3个dsRNA表达量最高的株系进行褐飞虱生物活性测定,结果发现,转基因水稻并没有表现出明显的褐飞虱抗性。对转基因水稻T1代植株进行Northern Blot实验,发现T1代植株可以表达靶标基因的dsRNA。这说明转基因水稻表达dsRNA这一性状能稳定地遗传至T1代,但是转基因水稻T0和T1代都没有表现出明显的褐飞虱抗性,这可能是由于植株内dsRNA浓度太低、摄取过程中dsRNA被降解或无法运输至靶标位点、有其他基因代替被降解的靶标基因发挥作用等原因所致。(本文来源于《浙江大学》期刊2013-05-01）
杨辉[9]（2012）在《芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因克隆、表达及分子改造》一文中研究指出果聚糖(Fructan)包含低聚果糖、高聚果糖,是一类主要以果糖残基为单体聚合而成的多糖,分子量范围分布较广。高聚果糖通常分为两大类,一类主要由β-(2,1)糖苷键连接而成,归类为菊糖(Inulin);另一类通常是以β-(2,6)糖苷键连接而成,归类为左聚糖或细菌型果聚糖(Levan)。果聚糖已经被证实具有多种生物学活性,在抗肿瘤,抗病毒,增强身体免疫等方面都有一定的效果。果聚糖还具有增强免疫应激,改善肠道失衡的功能,并且是一种很重要的食品添加剂,可以用于益生元、膳食纤维、低热食品、减肥产品、降脂产品生产,还可以作为乳化剂、保湿剂、凝胶剂等等使用。左聚糖在保湿性能上和目前化妆品行业需求大价格高昂的透明质酸具有同等效果,在化妆品行业的应用有极大潜力。地处亚热带的广西目前已经是全国最大的蔗糖生产基地,产量占全国蔗糖产量的60%以上。但是广西的蔗糖产业一直存在产品线比较单一,缺少高附加值产品的缺陷。利用蔗糖为原料开发高附加值产品符合地方经济可持续发展的需要,具有很大的意义。左聚糖蔗糖酶(levansucrase)又称为果糖基转移酶(fructosyltransferase,FTF,FTase,sucrose:2,6-D-fructan-6-D-fructosyltransferase,Lls,EC2.4.1.10),是一类可以将蔗糖水解成果糖和葡萄糖,并且可以将果糖基转移形成果聚糖的酶。本论文研究目的是利用现代微生物生物技术、分子酶工程等先进手段,克隆、表达并改造新的左聚糖蔗糖酶基因,以期提高其活力、稳定性和底物耐受性,并研究重组蛋白的酶学性质和其催化左聚糖形成的机制,为今后规模生产左聚糖打下应用研究基础。通过研究还可以比较和分析不同左聚糖蔗糖酶基因及其突变体的蛋白质结构差异和酶学性能差异,对研究糖苷水解酶大家族GH-J的催化结构域及有关左聚糖蔗糖酶活力、稳定性、产物谱的关键氨基酸残基的功能和机理研究提供理论支持。从土壤中分离了枯草芽孢杆菌sp.54A并通过物理诱变获得它的突变株sp.56A;从云南腾冲热海的温泉中分离了嗜热地芽孢杆菌sp.HB1。从比利时菌种保藏中心(BCCM)购买了Geobacillus thermoleovorans LMG9823。对所分离和购买的菌株进行了 16SrDNA序列分析比对,构建了它们之间的系统发育树。根据Genebank公布的左聚糖蔗糖酶序列设计引物,成功克隆了上述芽孢杆菌的左聚糖蔗糖酶基因。建立了未有报道过的一种基于 HSAB(High Concentration Sucrose and Aniline Blue Plate)筛选平板培养基的高效方法。利用苯胺兰染色选择产多糖微生物,利用培养基中高达10%的蔗糖浓度可以同时检测菌株左聚糖蔗糖酶聚合酶能力和水解能力。利用显色和水解圈双重指标筛选左聚糖蔗糖酶野生型菌株。HSAB平板的高渗透压使得它并不适合用于大肠杆菌重组子的筛选。于是我们又建立了一步法高效筛选左聚糖蔗糖酶重组子的平板选择方法。该方法是对文献报道的两步法筛选左聚糖蔗糖酶重组子方法的改进。以SS56A为模板构建了易错PCR的左聚糖蔗糖酶突变体库。通过一步法高效筛选突变体。获得了仅有一个氨基酸残基发生改变的突变体T305A(EPSS1),其在305位发生了 ALA替换THR。在左聚糖蔗糖酶SS56A的碳末端融合了来自Thermus thermophilus TtHB-8的一段与海藻糖合成酶热稳定性相关的结构域,构建了左聚糖蔗糖酶融合蛋白STHB6。分别以pSE380和pET30a(+)为基础,构建了重组左聚糖蔗糖酶SS54A、SS56A、T305A、HBR1、9823SB、融合蛋白STHB6的表达载体,在XL10 GOLD和Rossette(DE3)宿主中成功诱导表达。所得重组蛋白经过镍亲和层析纯化,达到电泳纯。对各重组左聚糖蔗糖酶的水解活力酶学性质进行了研究,结果表明它们的性质各有差异。其中SS54A的最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,Km值为5.71 mM蔗糖;Vmax 值为 3.2341μmol/min.mg protein。SS56A 的最适反应温度为45℃,最适pHH为为6.0,Km 值为 6.216 mM 蔗糖;Vmax 值为 43.29μmol/min.mg protein。T305A 的最适反应温度为 50℃,最适 pH 为 6.5,Km 值为 14.52 mM 蔗糖;Vmax 值为 64.52μmol/min.mg protein。STHB6的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,Km值为7.673 mM蔗糖;Vmax值为27.70μmol/min.mg protein。研究还表明左聚糖蔗糖酶的热稳定性受到不同pH的影响。多种金属离子、表面活性剂对水解活力有显着影响。MnC12表现出最强的激活作用,柠檬酸铁铵、CaC12、DTT也有显着激活作用。而AgN03、MgC12、SDS则有明显抑制作用。突变体T305A的底物亲和力有明显下降,但是水解活力具有相对较好的热稳定性,而且催化速度有明显提升,其Vmax比模板SS56A提升了 49%。T305A还能在较高温度和高底物浓度下保持生产左聚糖的高转化率。已有大多数文献报道的左聚糖蔗糖酶聚合生成左聚糖的最适蔗糖底物浓度都在5%-10%之间。而T305A在pH7.0,30℃,25%蔗糖底物浓度条件下反应24小时最高可达到多糖对果糖转化率71.36%。融合蛋白STHB6的Km略有增高,水解蔗糖的速度有一定下降,但是其在高温下聚合生成左聚糖的效率显着提高,生成左聚糖的最适温度提高到40℃,其在25%蔗糖底物浓度时于37℃反应30小时多糖对果糖转化率可以达到80.64%。结合同源建模比对分析突变体并预测有关氨基酸残基功能。首次发现了枯草芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶的ALA-309氨基酸残基对于该酶的热稳定性、催化速度有显着的影响。比较本研究中获得的SS54A、SS56A和T305A(EPSS1)左聚糖蔗糖酶,这叁个重组蛋白相互之间仅有一个氨基酸残基的差异。在SS54A重组蛋白中VAL替代了 ALA-309,其余氨基酸序列与SS56A完全一致。但SS54A的最适反应温度仅为35℃,而SS56A最适反应温度为45℃。SS54A的底物亲和能力(Km值为5.71 mM蔗糖)比SS56A(Km值为 6.216 mM)略高,但 Vmax(3.2341μmol/min.mg protein)值仅有 SS56A(43.29μmol/min.mgprotein)的7.5%,催化能力显着降低。目前尚未有文献报道过ALA-309氨基酸残基对左聚糖蔗糖酶结构和性能的影响。通过对重组左聚糖蔗糖酶生成左聚糖的酶学性质的研究,表明其最适温度、pH和底物浓度存在一定差异。获得的左聚糖蔗糖酶突变体T305A、STHB6显示了在高温、高底物浓度条件下保持果聚糖高转化率的性能。这些性能都是目前文献报道的左聚糖蔗糖酶较为缺乏的。多数报道的左聚糖蔗糖酶聚合果聚糖的最适底物浓度仅为5%-10%,一些酶合成果聚糖的最适温度为4℃,这些都是会影响实际生产的限制因素。我们的突变体酶具备了在高温(40℃)、高底物浓度(25%蔗糖)条件下的高转化率(对果糖70%-80%),具备了潜在的生产应用价值。总之,通过研究,我们建立了新的高效的左聚糖蔗糖酶野生菌和重组子筛选平台,筛选到多个性能优异的左聚糖蔗糖酶基因,并通过分子改造获得了性质不同的突变体酶,发现了一些和左聚糖蔗糖酶催化功能密切相关的重要氨基酸残基,这对于深入研究左聚糖蔗糖酶催化结构域以及具有同类催化结构域的糖苷水解酶家族GH68中相关酶的关键氨基酸残基的功能具有重要意义。(本文来源于《广西大学》期刊2012-12-01）
赵君[10]（2012）在《多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶基因的克隆与表达分析》一文中研究指出淀粉蔗糖酶(Amylosucrase)是一种新型葡萄糖基转移酶,属于糖苷水解酶家族13,是该家族中唯一一种具有聚合作用的酶。该酶催化蔗糖的水解反应不需要ADP或UDP等昂贵物质作为前体,而只需要廉价的蔗糖在糖苷键裂解时释放的能量,根据受体的不同可以合成淀粉、葡聚糖、寡糖和复合糖等。该酶的发现实现了人为的合成有目的的多糖、增加淀粉分子聚合度和分子量。为治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒类的多糖类药物的制备提供基础,并为增加淀粉分子链长和分子聚合度进而改变淀粉应用性质和品质,提供可实现的途径。因此,淀粉蔗糖酶将成为工业上合成多糖类聚合物的一种简单、方便、有效的葡萄糖基转移工具,具有广阔的发展空间。本研究根据奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶基因的保守序列设计引物,通过TD-PCR扩增方法克隆出多糖奈瑟球菌(ATCC43768)基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因AS,将其与pMD-18T载体连接,得到重组质粒T-AS。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET-AS,在E.coli.BL21中经IPTG进行诱导表达。通过响应面法对重组菌发酵工艺条件进行优化,提高淀粉蔗糖酶的酶活力。结果如下：1.利用梯度PCR技术从多糖奈瑟菌ATCC43768染色体基因组中扩增出淀粉蔗糖酶基因(AS),克隆到载体pMD-18T后进行测序,结果表明：克隆得到的AS基因序列与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株同源性达96%,对应的氨基酸同源性为97%。ATCC43768的AS基因与Neisseria mucosa C102(86%)、Neisseria macacae(86%)、Neisseria sp (85%)的淀粉蔗糖酶基因均有一定的同源性。2.构建重组表达质粒pET-AS,将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli.BL21(DE3)中,用诱导剂IPTG诱导重组菌淀粉蔗糖酶基因进行过量表达。通过对诱导时间,诱导剂浓度进行初步优化,确定了诱导表达的最佳条件因素为IPTG终浓度0.6mmol/L,诱导时间为5h。3.对重组菌的发酵条件进行单因素实验,确立了影响重组菌生长及酶表达的最佳单因素,分别为发酵温度35℃,发酵液初始pH6.5,接种量2%,摇床转速180rpm。在单因素实验的基础上,利用响应面分析法对淀粉蔗糖酶基因工程菌发酵工艺进行优化,发酵最佳工艺为：发酵温度35℃,发酵液初始pH6.5,接种量1.9%,摇床转速190rpm。酶活达到最大值39.4U/mL,酶活比多糖奈瑟球菌原菌提高了21.9倍。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2012-06-01）
蔗糖酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
以罗伊氏乳杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得果聚糖蔗糖酶基因lev。生物信息学分析表明:该基因全长1 776 bp,编码一个含591个氨基酸残基的多肽。该多肽的预测分子质量为65.47 ku,等电点为4.74,二级结构主要有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成。克隆所得的lev基因与Gen Bank注册的罗伊氏乳杆菌lev基因(注册号:EF534264.1)的核苷酸序列同源性为97.97%。本研究所得lev基因经构建表达载体在大肠杆菌BL21中表达,重组酶具有果聚糖蔗糖酶的活性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
蔗糖酶基因论文参考文献
[1].徐君,张言周,黎循航,管政兵,蔡宇杰.果聚糖蔗糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析[J].食品与生物技术学报.2019
[2].许本宏,林俊芳,郭丽琼,叶志伟,李娇娇.罗伊氏乳杆菌果聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达[J].中国食品学报.2017
[3].徐君.BacillusamyloliquefaciensH47果聚糖蔗糖酶基因的克隆、表达及其应用研究[D].江南大学.2016
[4].张磊.淀粉蔗糖酶基因定点突变及其酶学性质表征[D].吉林农业大学.2014
[5].李阳.菊粉内切酶和蔗糖酶基因的高效重组表达及其在水解菊粉中的应用[D].中国海洋大学.2014
[6].韩丽娜.受条锈菌诱导的小麦碱性/中性蔗糖酶基因（Tα-A/N-Inv）的克隆及功能分析[D].西北农林科技大学.2014
[7].张舟.明串珠菌乙酸激酶和葡聚糖蔗糖酶基因失活的研究[D].河北工业大学.2014
[8].于慧.利用RNAi技术抑制褐飞虱蔗糖酶基因和蔗糖转运子基因的研究[D].浙江大学.2013
[9].杨辉.芽孢杆菌左聚糖蔗糖酶基因克隆、表达及分子改造[D].广西大学.2012
[10].赵君.多糖奈瑟球菌淀粉蔗糖酶基因的克隆与表达分析[D].吉林农业大学.2012
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