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人诱导多能干细胞系的建立

2020-12-10阅读(349)

人诱导多能干细胞系的建立

论文摘要

本实验通过电转染法将Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、Rarg和Lrh18个外源转录因子导入人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblast,hEF）使其重编程为人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPS细胞）。一部分hiPS细胞接种到小鼠饲养层细胞上;另一部分接种到无饲养层细胞的培养体系中。在4种hiPS细胞培养液中一共成功建立了8个hiPS细胞系,有饲养层细胞和无饲养层细胞各4个细胞系。细胞分别命名为hiPS-ABCL、hiPS-2iLGOY、hiPS-E8、和hiPS-C2L。以人胚胎干细胞系hES-t2iLGOY和hESE8为对照,对新建立的无饲养层的4个hiPS细胞系的各项生物学特征进行了检测鉴定。4个hiPS细胞系在体外能长期稳定增殖,hiPS-E8细胞克隆形态呈扁平状,其余3个细胞系都呈椭圆状;hiPS-E8细胞碱性磷酸酶染色为弱阳性或阴性,其余3个细胞系碱性磷酸酶染色均为阳性。hiPS-ABCL、hiPS-2iLGOY、hiPS-E8、和hiPS-C2L细胞均表达多能基因Oct4、Sox2、Nanog,而其表达水平均低于对照组,而多能基因Zic2表达水平均高于对照组。hiPS-ABCL在免疫缺陷小鼠体内能形成畸胎瘤。但是连续传代的无饲养层hiPS-ABCL细胞核型不稳定且不具备分化为PGCLCs的能力。尽管hiPS细胞系建立技术已经发展相对成熟,但重编程过程仍然还有很多未知的因素且效率低下,本研究创建的新型hiPS制备及培养体系将会为未来hiPS研究提供一定的理论及技术基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 人诱导多能干细胞关键技术进展
  •   1.2 人诱导多能干细胞的调控机制
  •   1.3 人多能干细胞不同状态之间的相互转换
  •   1.4 人诱导多能干细胞的应用
  •     1.4.1 细胞分化调控
  •     1.4.2 药物筛选
  •     1.4.3 人遗传疾病的模拟
  •     1.4.4 再生医学
  •     1.4.5 组织器官发育和生理学
  • 第二章 人胚胎成纤维细胞培养及饲养层细胞的制备
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 主要仪器设备
  •     2.1.2 实验试剂
  •     2.1.3 实验动物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 主要试剂的配制
  •     2.2.2 小鼠成纤维细胞的分离培养
  •     2.2.3 STO细胞解冻与传代
  •     2.2.4 小鼠饲养层细胞制备与冻存
  •     2.2.5 人胚胎成纤维细胞的培养
  •     2.2.6 人胚胎成纤维细胞性别鉴定
  •     2.2.7 人胚胎成纤维细胞支原体检测
  •     2.2.8 人胚胎成纤维细胞核型分析
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 小鼠成纤维细胞形态学鉴定
  •     2.3.2 人胚胎成纤维细胞形态学鉴定
  •     2.3.3 人胚胎成纤维细胞鉴定结果
  •   2.4 讨论及小结
  • 第三章 人诱导多能干细胞系的建立
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 主要仪器设备
  •     3.1.2 主要试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 主要试剂的配制
  •   3.3 通过电转染方法将hEF重编程为hiPS细胞
  •   3.4 人诱导多能干细胞+Dox细胞的培养
  •     3.4.1 机械法传代细胞
  •     3.4.2 酶传消化细胞
  •     3.4.3 碱性磷酸酶染色鉴定
  •     3.4.4 人诱导多能干细胞+Dox细胞核型检测
  •   3.5 人诱导多能干细胞有饲养层细胞系的建立
  •     3.5.1 碱性磷酸酶染色鉴定
  •     3.5.2 外源基因表达检测
  •     3.5.3 实时荧光定量PCR
  •     3.5.4 加饲养层hiPS-ABCL细胞核型检测
  •   3.6 人诱导多能干细胞无饲养层细胞系的建立
  •   3.7 人胚胎干细胞复苏培养及诱导
  •   3.8 人诱导多能干细胞无饲养层细胞系得鉴定
  •     3.8.1 人多能干细胞碱性磷酸酶染色鉴定
  •     3.8.2 人多能干细胞的免疫荧光染色检测
  •     3.8.3 人多能干细胞的实时荧光定量PCR检测
  •     3.8.4 无饲养层hiPS-ABCL细胞核型检测
  •   3.9 实验结果
  •     3.9.1 人诱导多能干细胞+Dox细胞系的建立
  •     3.9.2 人诱导多能干细胞有饲养层培养体系的建立
  •     3.9.3 人诱导多能干细胞无饲养层细胞系的建立与鉴定
  •     3.9.4 免疫荧光染色和RT-qPCR结果分析
  •     3.9.5 饲养层细胞的ABCL细胞核型检测结果
  •   3.10 实验讨论及小结
  • 第四章 无饲养层hiPS-ABCL细胞发育潜能研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 主要仪器设备
  •     4.1.2 主要试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 主要试剂的配制
  •     4.2.2 无饲养层hiPS-ABCL细胞畸胎瘤制备
  •     4.2.3 tdTomato标记无饲养层hiPS-ABCL细胞系
  •     4.2.4 无饲养层hiPS-ABCL细胞发育潜能检测
  •     4.2.5 无饲养层hiPS-ABCL细胞向原始生殖样细胞诱导分化
  •     4.2.6 PGCLC细胞的免疫荧光染色
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 畸胎瘤结果分析
  •     4.3.2 td Tomato红色荧光标记hiPS-ABCL细胞结果
  •     4.3.3 无饲养层hiPS-ABCL细胞发育潜能检测
  •     4.3.4 无饲养层hiPS-ABCL细胞向原始生殖样细胞诱导分化
  •   4.4 实验讨论及小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王旭东

    导师: 包斯琴

    关键词: 人胚胎成纤维细胞,转录因子,电转染,诱导多能干细胞

    来源: 内蒙古大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 内蒙古大学

    分类号: Q813.1

    总页数: 56

    文件大小: 2254K

    下载量: 258

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