杨友华黄丹杨荣（江汉大学医学院生理学教研室430000）
【摘要】目的分离培养人羊膜间充质干细胞，观察其超微结构并进行研究。方法冲洗出废弃人羊膜，钝性法分离后，提取含羊膜间充质干细胞进行培养，流式检测鉴定同源性及表面纯度后用DMEM诱导分化使用电镜进行超微结构的全面观察。结果羊膜可成功分离培养出间充质干细胞，细胞贴壁生长，体外增殖和传代的周期短且稳定。具有与BMSCs相似的表面标志，体外可以诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论培养的人羊膜间充质干细胞能够作为组织工程学和细胞代替治疗的良好种细胞。
【关键词】人羊膜间充质干细胞超微结构观察研究
【中图分类号】R714.56【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）45-0181-02
人羊膜间充质干细胞（Humanamnioticmesenchymalstemcells，HAMSCs）,是存活于人体胎盘组织中的羊膜间的充质干细胞。近年来人羊膜间质干细胞作为新的种细胞，因其易于采集、分化程度高、低免疫原性、高干细胞质量、无风险副作用和伦理问题等优点越来越具应用性。故对羊膜间充质干细胞进行分化力［1］、免疫力、增殖力、造血、迁移等特性的观察研究具有十分重要的基础作用，可以为日后细胞移植的临床治疗应用提供更加科学和详尽的第一手资料。本文对人羊膜间质干细胞进行全面的超微结构观察来研究其增殖分化能力。
1材料与方法
1.1试剂和仪器
DMEM-LG培养基、新生胎牛血清购自Gibco公司；胰酶购自Peprotech公司；细胞计数试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；二氧化碳培养箱购自日本三洋公司；流式细胞仪购自美国BD公司；透射电子显微镜(TEM)JEM-ARM200F（日本电子株式会社）；扫描电子显微镜（SEM）荷兰Phenom有限公司；医院自配成脂诱导分化液和成骨诱导分化液。
1.2HAMSCs的原代培养
取产前血清学检查排除乙、丙肝炎、梅毒及艾滋病毒感染的足月妊娠剖宫产后废弃的胎盘，在无菌态下，在超净台内以PBS充分清洗胎盘残存血及污物。进行羊膜与绒毛膜间的钝性分离，获得半透明光滑的羊膜后用含100ug/lm新霉素、50ug/lm的青霉素和链霉素，及2.5ug/lm二性霉素的混合平衡盐溶液浸泡20min，取出后上皮面向上铺于滤纸上，剪成规格大小3×4cm长方块后卷成筒状以丝线固定。置于DMEM-LG培养液中，在二氧化碳浓度含量5%、湿度95%，温度37℃的培养箱中条件培养。始初24h更换新液，去未贴壁细胞，第1次传代后每4d按1：3比例传代，进行扩增培养［2］。
1.3HAMSCs细表抗原测定
收集第4代人羊膜间充质干细胞，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后收集细胞，以含1%胎牛血清的磷酸盐（PBS）调整细胞浓度制得细胞悬液。取出50μL分别加入抗体，在4℃低温下孵育30min,PBS平衡液清洗3次后使用流式细胞仪分析。
1.4HAMSCs细胞诱导分化
收集第4代人羊膜间充质干细胞，无菌态下分别进行成脂细胞分化诱导和成骨细胞分化诱导，并进行染色检验。
1.5HAMSCs细胞内部结构观察
收集第4代人羊膜间充质干细胞进行培养，待细胞铺满培养瓶后，采用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，细胞刮子将细胞刮落，以半径18cm转速1000r/min进行10min离心，取得常规透射电镜标本处理后，在JEM-ARM200F透射电镜下观察细胞内部的超微结构；同时将第4代充质干细胞以1*104/ml密度接种于12板孔中，当细胞70%融合时使用PBS缓冲液冲洗，在4℃下冷却一晚后进行二次洗涤4摄氏度低温冷却1h，脱水后室温置换2h，经液态二氧化碳临点干燥、粘托，喷金于扫描电镜下观察。
2结果
2.1HAMSCs的分离培养
在含1%PBS的DMEM-LG培养液，约7d组织块周开始出现细胞涌出现象。此后，细胞数量逐渐增多。取HAMSCs按特定浓度接种于12孔板中，每日固定时间内分别提取3个孔中的细胞计数，取均值并绘生长曲线。结果显示，HAMSCs曲线图符合BMSCs的生长特点，对数生长期倍增周期约为30h。
2.2HAMSCs表型特征
经流式细胞仪检测，HAMSCs具有较高稳定性，其抗体表达如表1：
表1HAMSCs抗体表达表
克隆抗体名称阳性率（%）阴性
CD4498.70±0.23
CD2997.69±0.12
CD10599.20±0.03
CD31阴性
CD34阴性
CD45阴性
HLA-DR阴性
CD11a阴性
CD11b阴性
Pa-CK阴性
2.3HAMSCs表型特征
透射电镜下观察，HAMSCs细胞表现为两种不同形态：一种为椭圆大细胞核，胞质内仅有稀少细胞器，单核仁且核质比大。这种细胞功能处于相对静息态；另一种细胞体积大于前者，核质比轻，含2-3核仁且呈不规则形，有核袋及核突，胞质内含线粒体、高尔基复合体、粗面内质网等细胞器，该细胞功能相对活跃。胞间可见胞膜局部电子密度升高的缝隙连接。扫描电镜下观察可见细胞呈细长梭形成纤维细胞样克隆或多角形上皮细胞样克隆，细胞表有短粗微绒突起。
3讨论
HAMSCs是从废弃的人体羊膜组织中分离培养出的充质干细胞，与BMSCs具有相似的多向分化潜力和自体更新能力，易于取材，来源稳定且广泛，不涉及伦理限制，是组织工程学和细胞移植的绝佳种细胞材料。传代中，视细胞粘附力，调整胰酶消化时长，保证HAMSCs的迅速分离，从而使其逐步纯化。通过流式细胞仪证实HAMSCs拥有较高的同源性，并在体外能够向脂肪和成骨细胞诱导分化，证实了HAMSCs与BMSCs的生物学特性高度相似。透视及扫描电镜均表明HAMSCs生长贴附度高、增殖能力强，分化程度高。
参考文献
[1]韩忠朝.间充质干细胞基础与临床[M]第1版.北京：科学出版社，2012.
[2]金钧.黄坚.王俊.付建红.体外羊膜间充质干细胞分离培养及神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(32)5939-5943.