论文摘要
大量研究发现胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)与非生物胁迫抗性相关。根据蛋白保守结构域特点,LEA分为7个家族,其中LEA3家族含有11个氨基酸组成的保守基序(motifs)。文献报道几乎所有LEA3蛋白为无序蛋白,具有类分子伴侣功能。本论文前期研究发现,耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)中含有3个与LEA同源的蛋白(DR1172,DR0105和DR1372),但其胁迫抗性机制尚不清楚。本研究中,我们鉴定了一个Deinococcus属特有的LEA3蛋白DR1172,该蛋白含有一个由11个氨基酸组成的保守基序的亲水结构域HD(Hydrophilic Domain,HD),为亲水蛋白,二级结构测定为有序结构,因此将其命名为DohL(Deinococcus ordered hydrophilic LEA3,DohL)。为研究DohL作用机制,我们从DohL结构、生理功能展开研究,主要研究结果如下:1.圆二色谱结果表明,DohL是一种具有有序结构的全新的LEA3蛋白,其α-螺旋度为26.9%,远高于已报道的LEA3蛋白。在50%甘油和50%三氟乙醇(TFE)诱导后,DohL的α-螺旋度分别增加至93.4%和99.8%,二级结构更加有序。氧化胁迫下,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和数字PCR(ddPCR)结果显示,dohL表达量下降;而蛋白质免疫印记(Western Blot)结果显示,DohL表达量增加,推测该蛋白可能在蛋白水平发挥功能。2.表型结果显示,dohL突变后导致菌株氧化抗性减弱,表明DohL的功能与氧化胁迫抗性相关。氧化胁迫下,dohL基因的缺失导致菌体细胞过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达和酶活显著下降,进一步表明DohL蛋白能够增强耐辐射异常球菌的氧化抗性。3.HD亲水结构域均能不同程度回补突变株ΔdohL氧化抗性,尤其是回补株Com-DHD16(含有16个motifs),Com-dohL(含有8个motifs)和Com-HD(含有8个motifs)几乎完全回补突变株氧化抗性,回补株Com-THD4-1(前端4个motifs)和Com-THD4-2(后端4个motifs)回补能力相近。5个重组蛋白过表达菌株能够增强大肠杆菌的氧化胁迫抗性,抗氧化能力强弱与突变株回补实验结果一致。结果表明:HD亲水结构域对DohL发挥氧化功能至关重要,且HD的保守基序数量与抗氧化能力存在相关性。4.蛋白-蛋白互作结果显示,DohL与HD能够结合乳酸脱氢酶(LDH),氧化胁迫后,结合力显著增强。酶活和聚合度实验进一步表明,氧化胁迫下5种HD亲水结构域均能够保护氧化胁迫条件下LDH活性并防止其发生聚集。推测,DohL和HD具有类分子伴侣功能,且HD亲水结构域对DohL类分子伴侣功能的发挥至关重要。5.DohL核酸酶活性结果显示,DohL在不需要ATP的情况下能够切割环状质粒;氧化胁迫条件下,DohL催化活性高于T7核酸内切酶。推测DohL可能在清除氧化胁迫条件下DNA断裂片段中具有重要功能。综上所述,DohL是一个具有类分子伴侣和核酸内切酶功能的有序蛋白,在耐辐射异常球菌适应极端环境过程中可能发挥重要作用。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 刘盈盈
导师: 王劲
关键词: 耐辐射异常球菌,有序结构,亲水结构域,类分子伴侣,核酸酶
来源: 中国农业科学院
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 中国农业科学院
分类号: Q936
总页数: 113
文件大小: 7345K
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