耐辐射异常球菌亲水蛋白DohL具有类分子伴侣和核酸内切酶功能并参与氧化胁迫保护

论文摘要

大量研究发现胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）与非生物胁迫抗性相关。根据蛋白保守结构域特点,LEA分为7个家族,其中LEA3家族含有11个氨基酸组成的保守基序（motifs）。文献报道几乎所有LEA3蛋白为无序蛋白,具有类分子伴侣功能。本论文前期研究发现,耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）中含有3个与LEA同源的蛋白（DR1172,DR0105和DR1372）,但其胁迫抗性机制尚不清楚。本研究中,我们鉴定了一个Deinococcus属特有的LEA3蛋白DR1172,该蛋白含有一个由11个氨基酸组成的保守基序的亲水结构域HD（Hydrophilic Domain,HD）,为亲水蛋白,二级结构测定为有序结构,因此将其命名为DohL（Deinococcus ordered hydrophilic LEA3,DohL）。为研究DohL作用机制,我们从DohL结构、生理功能展开研究,主要研究结果如下:1.圆二色谱结果表明,DohL是一种具有有序结构的全新的LEA3蛋白,其α-螺旋度为26.9%,远高于已报道的LEA3蛋白。在50%甘油和50%三氟乙醇（TFE）诱导后,DohL的α-螺旋度分别增加至93.4%和99.8%,二级结构更加有序。氧化胁迫下,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和数字PCR（ddPCR）结果显示,dohL表达量下降;而蛋白质免疫印记（Western Blot）结果显示,DohL表达量增加,推测该蛋白可能在蛋白水平发挥功能。2.表型结果显示,dohL突变后导致菌株氧化抗性减弱,表明DohL的功能与氧化胁迫抗性相关。氧化胁迫下,dohL基因的缺失导致菌体细胞过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）基因表达和酶活显著下降,进一步表明DohL蛋白能够增强耐辐射异常球菌的氧化抗性。3.HD亲水结构域均能不同程度回补突变株ΔdohL氧化抗性,尤其是回补株Com-DHD16（含有16个motifs）,Com-dohL（含有8个motifs）和Com-HD（含有8个motifs）几乎完全回补突变株氧化抗性,回补株Com-THD4-1（前端4个motifs）和Com-THD4-2（后端4个motifs）回补能力相近。5个重组蛋白过表达菌株能够增强大肠杆菌的氧化胁迫抗性,抗氧化能力强弱与突变株回补实验结果一致。结果表明:HD亲水结构域对DohL发挥氧化功能至关重要,且HD的保守基序数量与抗氧化能力存在相关性。4.蛋白-蛋白互作结果显示,DohL与HD能够结合乳酸脱氢酶（LDH）,氧化胁迫后,结合力显著增强。酶活和聚合度实验进一步表明,氧化胁迫下5种HD亲水结构域均能够保护氧化胁迫条件下LDH活性并防止其发生聚集。推测,DohL和HD具有类分子伴侣功能,且HD亲水结构域对DohL类分子伴侣功能的发挥至关重要。5.DohL核酸酶活性结果显示,DohL在不需要ATP的情况下能够切割环状质粒;氧化胁迫条件下,DohL催化活性高于T7核酸内切酶。推测DohL可能在清除氧化胁迫条件下DNA断裂片段中具有重要功能。综上所述,DohL是一个具有类分子伴侣和核酸内切酶功能的有序蛋白,在耐辐射异常球菌适应极端环境过程中可能发挥重要作用。

论文目录

摘要

abstract

英文缩略表

第一章引言

1.1 LEA蛋白研究进展

1.1.1 LEA蛋白概述

1.1.2 LEA蛋白的结构与特征

1.1.3 LEA蛋白的功能及其保护机理研究

1.1.4 LEA第3 家族蛋白研究进展

1.2 耐辐射异常球菌研究综述

1.2.1 耐辐射异常球菌的极端抗性

1.2.2 耐辐射异常球菌LEA蛋白研究进展

1.3 立题依据和研究意义

第二章耐辐射异常球菌DohL蛋白结构特点及诱导表达调控分析

2.1 材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 培养基及抗生素溶液配制

2.1.3 主要仪器

2.1.4 酶类、生化试剂及试剂盒

2.1.5 常用缓冲液及试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养条件

2.2.2 重组E.coli菌株构建

2.2.3 细菌RNA的提取及荧光定量PCR

2.2.4 数字PCR（Digital droplet PCR）

2.2.5 Western Blot检测

2.2.6凝胶阻滞实验

2.3 结果与分析

2.3.1 耐辐射异常球菌DR1172 蛋白生物信息学分析

2.3.2 DR1172 蛋白表达载体的构建

2.3.3 DR1172 诱导表达与纯化

2.3.4 DohL蛋白的二级结构特点

2.3.5 dohL基因诱导表达及调控

2.4 讨论

第三章 DohL突变株的表型分析及体内抗氧化酶活性测定

3.1 材料

3.1.1 菌株和载体

3.1.2 主要仪器

3.1.3 酶类、生化试剂及试剂盒

3.2 方法

3.2.1 引物设计及PCR反应

3.2.2 连接

3.2.3 E.coli热激转化

3.2.4 菌落PCR及酶切鉴定

3.2.5 耐辐射异常球菌线性DNA转化方法

3.2.6 ?dohL回补菌株和过表达菌株的构建

3.2.7 耐辐射异常球菌非生物胁迫实验

3.2.8 体内总抗氧化能力测定

3.2.9 体内抗氧化酶活性测定

3.2.10 体内乳酸脱氢酶（LDH）活性测定

3.3 结果与分析

3.3.1 突变株?dohL构建和验证

3.3.2 ?dohL回补菌株和dohL过表达菌株的构建和验证

3.3.3 dohL缺失后导致菌株氧化和干燥抗性下降

3.3.4 dohL基因缺失导致体内总抗氧化能力下降

3.3.5 dohL基因缺失导致体内抗氧化酶活性下降

3.3.6 dohL基因缺失导致体内乳酸脱氢酶酶活性下降

3.3.7 突变株?dohL对体内抗氧化酶和乳酸脱氢酶相关基因表达量的影响

3.4 讨论

第四章 DohL蛋白HD亲水结构域功能研究

4.1 材料和方法

4.1.1 实验菌株及质粒

4.1.2 常用缓冲液及试剂的配制

4.1.3 重组E.coli菌株构建

4.1.4 重组E.coli氧化胁迫冲击实验

4.1.5 微量热泳动仪（MST）实验

4.1.6 乳酸脱氢酶（LDH）体外酶活和聚合度测定

4.2 结果与分析

4.2.1 HD亲水结构域相关蛋白表达载体的构建

4.2.2 HD亲水结构域相关蛋白的诱导表达与纯化

4.2.3 氧化胁迫条件下HD亲水结构域功能分析

4.2.4 DohL和 HD能够与LDH相互作用

4.2.5 HD亲水结构域相关蛋白能够保护LDH酶活

4.2.6 HD亲水结构域相关蛋白能够减少LDH发生聚集

4.3 讨论

第五章 DohL蛋白核酸内切酶功能验证

5.1 材料和方法

5.1.1 实验菌株和质粒

5.1.2 常用缓冲液配制

5.1.3 脉冲场凝胶电泳

5.1.4 核酸内切酶测定

5.2 结果与分析

5.2.1 氧化处理后突变株的基因组不能恢复

5.2.2 DohL具有核酸内切酶功能

5.3 讨论

第六章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘盈盈

导师: 王劲

关键词: 耐辐射异常球菌,有序结构,亲水结构域,类分子伴侣,核酸酶

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q936

总页数: 113

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耐辐射异常球菌亲水蛋白DohL具有类分子伴侣和核酸内切酶功能并参与氧化胁迫保护

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