海藻糖-6-磷酸（T6P）荧光探针的开发

论文摘要

海藻糖-6-磷酸（T6P）是海藻糖代谢的中间产物,也是调节植物糖代谢等生理过程的信号分子。T6P产生和降解的精确调节对于确保生物体在环境和营养变化下的适应性至关重要。近年来,随着研究的不断深入,发现T6P作为信号分子,在调控植物胚胎发育、气孔开放、叶片衰老以及开花时间等方面有着重要作用。尽管T6P在植物中有着重要作用,但对于T6P的检测却是当前的一大难点。这是因为细胞内T6P浓度较低,研究发现植物中T6P含量仅有0.1-15μM,且生物体内还存在T6P的同分异构体蔗糖-6-磷酸（S6P）,使用质谱检测具有一定的困难,二者基线很难分离,也无法选择性地测量细胞内游离的T6P或者监测其在同一细胞内随时间的动态变化。为了更好地研究生物体内T6P的动态变化及生理作用,亟需一种新的方法来对体内T6P定量。近年来,基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码荧光探针被广泛应用于检测活细胞内多种信号分子以及代谢物(Ca2+、ROS、ATP、氨基酸、H2O2、糖类、激素类),这些细胞内小分子的实时定量监测对人们研究生物体内信号传递具有重要的意义。基于此,本研究设计了一种基于FRET原理的荧光探针来监测体内T6P的动态变化。基于FRET的基因编码的荧光探针是由嵌合蛋白组成,嵌合蛋白由中间配体结合蛋白与两种不同波长的荧光蛋白融合而成,靶分子的结合引起了中间配体结合蛋白构象的变化,改变了荧光团之间的距离,从而产生能量的传递。本研究使用突变后无活性但能和T6P特异性结合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶（AtTPPG）作为T6P的特异性识别元件,将其插入供体绿色荧光蛋白（Clover）与受体红色荧光蛋白（mRuby2）之间,设计成用于监测T6P动态变化的荧光探针。通过对AtTPPG定点突变的筛选,以及利用激光共聚焦显微镜成像统计和体外荧光蛋白寿命检测,得到监测T6P的荧光探针,分别命名为CR-Mu1、CR-Mu2、CR-Mu3。在大肠杆菌体内,三种探针均能特异性识别T6P,监测不同浓度T6P的变化,三者都随T6P浓度的改变使得荧光强度发生变化,即供体荧光逐渐减弱,而受体荧光逐渐加强。综合对比几种探针,发现CR-Mu3的效果最好。本研究在体外以及大肠杆菌和酵母体内对T6P探针的性能进行了表征和验证,表明本实验设计的T6P探针可以监测T6P含量的变化,这对研究生物体内T6P的代谢过程以及响应胁迫机制,有重要的指导意义。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 曹艳艳

导师: 张宇

关键词: 荧光探针,海藻糖磷酸磷酸酶

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南大学

分类号: Q503

总页数: 77

文件大小: 6855K

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