牛廷献[1]2003年在《旋毛虫新生幼虫期特性基因的克隆、表达及抗原性研究》文中进行了进一步梳理利用地高辛标记的旋毛虫新生幼虫期特异性核酸探T68对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选，获得1个全长为1609 bp的cDNA分子。该cDNA含有1个1395bp的开放阅读框架(ORF)，该ORF编码1个465个氨基酸残基组成的多肽，其分子量理论推导值为50.1kDa，等电点(IP)为9.7。蛋白质序列分析显示，31～64位氨基酸为信号肽序列，N末端前31～64个氨基酸以疏水性为主，而其亲水性区域位于C末端。Blastn同源性分析表明，与其他已知生物基因序列无明显的同源性，为1个新的cDNA分子，命名为：T668，GenBank注册号为：AF331160.1。Blastp蛋白质同源性分析表明，T668与丝氨酸蛋白酶(U62659)同源性达38％。同时，从cDNA文库筛选获得1个克隆G10-7，编码此蛋白C-末端275个氨基酸残基。应用PCR技术，从筛选得到的pBK-CMV-G10-7和pBK-CMV-T668重组质粒中分别扩增到G10-7和不含信号肽序列的T668基因片段，与pMD18-T载体连接后进行克隆，再将其分别克隆于原核表达载体pET28，成功地构建了pETG10-7、pETT668重组表达质粒，将其转化到E.coli表达菌株BL21(DE_3)感受态细胞中，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明，G10-7和T668表达融合蛋白的分子量分别为34kDa和49kDa。薄层扫描结果显示，随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加，在分别诱导4、5h时，表达量达到高峰，目的蛋白分别占菌体总蛋白的61.7％和34.6％。Western-blotting检测显示，两种蛋白均可被感染旋毛虫阳性猪血清所识别，表明两种蛋白均具有良好的反应原性，为旋毛虫病的早期诊断及防制提供了新的潜在抗原。 为了研究重组蛋白对旋毛虫病诊断的特异性、敏感性及其免疫保护性，以重组蛋白为抗原，并以排泄／分泌(ES)抗原作为检测对照，以兔抗旋毛虫血清、猪抗旋毛虫血清及人抗旋毛虫血清为一抗，分别以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、羊抗猪IgG和山羊抗人IgG为二抗，建立了检测兔、猪和人旋毛虫抗体的间接ELISA方法。结果表明，以G10-7、T668重组蛋白为抗原诊断旋毛虫病，敏感性强、检出率高，且与ES抗原检测结果完全一致。可见，重组抗原有望代替ES抗原，且G10-7重组抗原可以代替T668重组抗原诊断旋毛虫病。以T668、G10-7 重组蛋白为抗原免疫小鼠，每间隔1周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后1周， 每只小鼠攻击感染200条旋毛虫感染性肌幼虫（ML），感染后5周用消化法检查ML 负荷。同时，用 ELISA方法检测攻击感染后 1～5周血清中抗 NBL IgG滴度。结果 表明，T668、G10－7重组蛋白免疫组 ML减虫率分别为 67．0％和 63．3％，明显高于 仅用佐剂组（5．4％和 5．8％）；血清中抗重组抗原哈G滴度也明显升高。可见，T668、 G10－7重组蛋白均能诱导小鼠产生特异性体液免疫及免疫保护，有望成为旋毛虫基 因工程疫苗的侯选抗原。 在原核表达的基础上，依据Te、G10－7基因序列设计引物，分别以 pBK－CMVT668和 PBK－CWG10－7为模板，扩增出m－7和含有信号肽的 T668目 的片段，将其分别克隆于真核表达载体 PCR3．1，构建 pCRG－7和 pCRT668真核表 达载体。经脂质体转染于COS－7细胞，经培养后，分别取不同时段的COS。7细胞裂 解物和培养物上清，ELISA检测其表达蛋白的反应原性。结果表明，pCRG10－7和 pCRT668重组质粒在COS－7细胞中的瞬时表达产物均具有良好的反应性。从而为旋 毛虫核酸疫苗的研制奠定了实验基础。
孙磊[2]2007年在《旋毛虫期特异性基因转录及表达特性研究》文中进行了进一步梳理由于旋毛虫存在叁个不同的发育时期,而各个发育时期具有不同的抗原表达,因此研究旋毛虫期特异性基因有助于探明旋毛虫侵袭、致病机理以及包囊形成的分子机制。我们利用分子生物学和免疫学方法对本室业已发现的2条新生幼虫期特异性(即旋毛虫包囊形成时期)基因——II型脱氧核糖核酸酶基因T314和丝氨酸蛋白酶基因T668进行了转录及表达特性研究,并探讨了其参与旋毛虫寄生及包囊形成过程中的可能机制。根据T314和T668 cDNA序列设计特异引物,从感染旋毛虫的小鼠骨骼肌中提取总RNA,应用RT-PCR技术分别反转录出T314和T668 cDNA,在分子水平上对这2个基因的转录时空进行了鉴定。结果显示:T314、T668基因均从新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加mRNA的量逐渐减少,T314 mRNA在感染后第20天仍能检测到,而T668 mRNA于感染后11-14天转录趋于停止。分别利用本室制备的兔抗T314和T668重组蛋白抗体,采用免疫组化技术,观察T314和T668基因编码蛋白的组织学定位。结果表明:T314、T668蛋白在新生幼虫感染后第1天均有表达,T314蛋白分布于虫体表皮,而T668蛋白分布于虫体的杆状体区域;T314蛋白在感染后7-20天分泌到虫体外的保姆细胞细胞质上,而T668蛋白则在感染后6-13天分泌到虫体外肿大的肌细胞核上。该结果预示着:T314蛋白(即DNase II)可能与旋毛虫寄生所需要厌氧环境的形成有关,可能的机制为DNase II降解线粒体DNA,使包囊内的有氧代谢转变为无氧代谢;而T668蛋白(即丝氨酸蛋白酶)可能参与包囊的形成,其可能的机制是作为转录因子调控肿大的肌细胞核大量表达胶原蛋白从而形成包囊。从pMD-18T-T314重组质粒中扩增T314目的片段,重组到PCR II载体中。利用SP6和T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA。通过浸泡将siRNA导入新生幼虫体内进行T314基因沉默,发现T314基因沉默后虫体总数减少,形成的包囊大部分空泡化,初步验证T314基因可能与旋毛虫包囊形成无关。
冯晓静[3]2009年在《旋毛虫新生幼虫期特异性T668蛋白抗原表位分析与鉴定》文中认为旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因是本室发现的一条高反应原性的期特异性抗原基因,该基因编码旋毛虫丝氨酸蛋白酶。基于该基因原核表达产物具有很强的反应原性,为进一步提高检测抗原的特异性,对该基因进行抗原表位筛选,可为进一步研制基于抗原表位的旋毛虫早期诊断试剂奠定基础。本实验对T668基因序列(GenBank:AF 331160.1)的亲水性、抗原性、表面可及性等特性进行生物信息学分析。根据分析结果设计4对特异引物,通过PCR的方法分别扩增含有活性位点His、Asp、Ser的叁个核酸片段以及C端亲水区(命名为T668H),克隆至表达载体pGEX-4T-1,将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达,经谷胱甘肽亲和柱层析得到纯化的GST-重组蛋白(Ser位点段未能成功表达,推测可能为丝氨酸蛋白酶的毒性位点区),用猪抗旋毛虫阳性血清对纯化的GST-重组蛋白进行Western blot和ELISA分析。结果表明T668蛋白C端亲水区(即T668H)为主要表位决定区。根据T668H的氨基酸序列设计16个部分重迭的短肽,根据短肽序列合成16对寡核苷酸链,退火,形成小段DNA,直接克隆至pGEX-4T-1表达载体,将成功构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达,经谷胱甘肽亲和柱层析得到纯化的GST-融合短肽,以纯化的GST-融合短肽为抗原,以猪抗旋毛虫阳性血清为一抗,进行Western blot和ELISA分析。结果初步确定了7个抗原表位,其中有3个抗原表位的反应信号最强,可作为研制旋毛虫诊断试剂的候选表位。
高长玲[4]2005年在《旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的克隆与分析》文中指出本研究利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5 cDNA 作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA 文库进行核酸杂交筛选,将阳性克隆全部送测序公司测序。将测序结果进行序列分析,95 个阳性克隆均含信号肽,属于分泌蛋白;且根据信号肽不同共分为15 种基因,其中13 种基因均为旋毛虫未知基因序列。InterProScan 检索表明15 种氨基酸序列均编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ,含有脱氧核糖核酸酶Ⅱ的保守序列。应用PCR 技术,将旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10 的信号肽去除后,重组到原核表达载体pET-28a,将重组质粒依次转入克隆菌NovaBlue 与表达菌BL21star(DE3),用IPTG 诱导培养重组表达菌进行原核高效表达。并将N10 重组蛋白提取包涵体,并对其可溶性蛋白酶的活性作初步鉴定。本实验成功地对旋毛虫新生幼虫cDNA 文库进行核酸杂交筛选,获得旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族;将具有代表性的基因N10 克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌中进行高效表达;并将N10表达的融合蛋白酶的活性进行初步鉴定,达到预期结果。
任瑞文[5]2001年在《旋毛虫新生幼虫期特异性基因的筛选与表达》文中进行了进一步梳理旋毛虫新生幼虫（NBL）是旋毛虫生活史中唯一非细胞内寄生并在血液中移行，对宿主免疫作用最为敏感的时期。因此，加强NBL抗原分子水平的研究，利用基因工程技术来制备NBL有效抗原对于旋毛虫病的诊断和预防具重要意义。本实验在已构建好的NBL差减文库的基础上，用southern杂交鉴定了NBL差减文库cDNA片段T_(68)，结果显示其仅与NBLcDNA文库杂交，为NBL期特异性cDNA片段。用地高辛标记此期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交从NBL cDNA文库中调取其全长cDNA，获得一1609bp全长序列SSC2，其中包含1395bp的开放阅读框架。登陆国际NCBI基因数据库进行同源性检索未见相似序列。登陆NCBI蛋白数据库进行相似性比较，该编码蛋白与旋毛虫丝氨酸蛋白酶相似性最高，达38％。蛋白位点和序列模式分析显示可将其归类为胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶。蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3分析其编码蛋白，结果显示其编码蛋白分子量为50.1kDa、等电点为9.775，N末端30～64个氨基酸可能为其信号肽区域，C末端亲水性较高，其抗原活性也较高。分别用GORⅠ、Gibrat、DPM、Predator方法预测其二级结构显示其结构较复杂，初步将其划分为信号肽区-绞合区-功能区-无规则卷曲区四个区域。登陆SMISS-MODEL自动蛋白质同源模建服务器，搜索、优化后初步预测了编码蛋白3D结构模型。根据测序及对其编码蛋白分析结果，利用ZAP表达系统，初步表达了该编码蛋白的抗原活性区片段，SDS-PAGE电泳显示与对照比较于30.5kDa处出现一特异性带，与预期结果相符，表达量在20％以上，为进一步研究其特性奠定了基础。 根据本室提供的NBL期特异性T_(3-1)D_4全长cDNA SSC1，由其信号肽下游设计上游引物PT_(3-1)D_4（AGGTCGACGTTGCAACATGCAAAAACG），并于其5’端加一SalⅠ酶切位点，下游引物采用ZAP Express载体自带T7引物（TAATA CGACTCACTATAGGG）扩增目的基因，克隆入pMD18 T载体后，用SalⅠ和XhoⅠ切下，根据目的片段的读码框架，克隆入表达载体pET28b，构建其原核表达载体pET28b-SSC1。分别用SalⅠ和XhoⅠ、SmaⅠ和Hind Ⅲ双酶切；XbaI单酶切鉴定重组子，结果均与预期相符，进一步测序结果也表明重组载体读码框架正确，可用于进一步诱导表达。
赵雪, 申丽洁[6]2007年在《旋毛虫新生幼虫抗原保护性免疫的研究进展》文中研究说明旋毛虫新生幼虫抗原具有很好的免疫原性,有明显的抗旋毛虫保护性免疫作用。本文介绍了旋毛虫新生幼虫抗原保护性免疫研究的新进展。
牛廷献, 刘明远, 卢强, 付宝权, Pascal, Boireau[7]2005年在《旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定》文中研究指明目的对旋毛虫新生幼虫期特异性T668cDNA进行表达及鉴定,以获得基因工程抗原。方法应用PCR技术,从pBK CMV T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段,将目的基因克隆于原核表达载体pET28a(+),构建pETT668重组质粒,再将其转化到E.coli表达菌株DE3感受态细胞中,经IPTG诱导表达,以SDS PAGE鉴定表达产物。结果pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加,诱导5h时表达量达到高峰;薄层扫描结果显示,目的蛋白占菌体总蛋白的34.6%。Western blotting检测显示,表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达,且表达蛋白具有良好的抗原性。
刘相叶[8]2009年在《旋毛虫与宿主肠粘膜上皮细胞相互作用蛋白的筛选》文中研究指明本研究为筛选旋毛虫与宿主肠粘膜上皮细胞相互作用蛋白，首先通过实验的方法确定收集旋毛虫肠道感染性第一期幼虫的最佳时间为经口灌服感染性第一期幼虫后6h。进而用Trizol试剂提取旋毛虫肠道感染性第一期幼虫总RNA，以纯化的肠道感染性第一期幼虫mRNA为模板反转录合成cDNA，将其两端加上EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端后连接到T7 Select 103b载体，包装蛋白包装后，对构建好的文库进行扩增。最后利用胶原酶消化法，分离新生仔猪肠粘膜上皮细胞，并进行大量的体外培养。以分离到的新生仔猪肠粘膜上皮细胞为靶标，利用全细胞筛选法对构建的旋毛虫肠道感染性第一期幼虫T7噬菌体展示cDNA文库进行筛选。本研究首次成功构建了旋毛虫肠道感染性第一期幼虫T7噬菌体展示cDNA文库，文库的库容量为6.0×10 5 Pfu，扩增后的文库滴度为1.9×10 12 Pfu/mL，重组率为98%，95%的插入片段在2502000bp之间；通过改进的胶原酶消化法成功的分离得到了新生仔猪肠粘膜上皮细胞，并对其进行了大量的体外培养；首次以全细胞筛选法成功的筛选到了旋毛虫与宿主肠粘膜上皮细胞相互作用蛋白，命名为IECTsp。I ECTsp基因的成功筛选为研究旋毛虫与宿主间信号转导以及旋毛虫侵入机体的机制奠定了基础。
参考文献：
[1]. 旋毛虫新生幼虫期特性基因的克隆、表达及抗原性研究[D]. 牛廷献. 中国人民解放军军需大学. 2003
[2]. 旋毛虫期特异性基因转录及表达特性研究[D]. 孙磊. 吉林大学. 2007
[3]. 旋毛虫新生幼虫期特异性T668蛋白抗原表位分析与鉴定[D]. 冯晓静. 吉林大学. 2009
[4]. 旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的克隆与分析[D]. 高长玲. 吉林大学. 2005
[5]. 旋毛虫新生幼虫期特异性基因的筛选与表达[D]. 任瑞文. 中国人民解放军军需大学. 2001
[6]. 旋毛虫新生幼虫抗原保护性免疫的研究进展[J]. 赵雪, 申丽洁. 中国病原生物学杂志. 2007
[7]. 旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定[J]. 牛廷献, 刘明远, 卢强, 付宝权, Pascal, Boireau. 中国寄生虫病防治杂志. 2005
[8]. 旋毛虫与宿主肠粘膜上皮细胞相互作用蛋白的筛选[D]. 刘相叶. 吉林大学. 2009
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