多溴联苯醌诱导parthanatos样细胞死亡、铁自噬和铁死亡的发生以及毒性机制分析

论文摘要

多溴联苯醚（PBDEs）是一类现在仍被广泛使用的溴系阻燃剂,具有生物蓄积能力,目前大量存在于生物体和非生物体内,并且已被证明能严重危害人类健康。多溴联苯醌（PBDEQ）是卤代芳香烃类化合物PBDEs的代谢产物。作为一种醌类物质,PBDEQ比PBDEs生物活性更高。一般来说,醌（例如:1,4-苯醌、多氯联苯醌、双酚A醌和多环芳烃氢醌）能同DNA进行Michael加成反应,除此之外,醌类物质也能通过半醌自由基或者对苯二酚-半醌类化合物在氧化还原循环中产生活性氧,进而引起氧化应激反应,最终诱导细胞毒性,遗传毒性等毒性作用。第一部分:PBDEQ诱导Hela细胞产生遗传毒性。在本章实验中我们发现PBDEQ具有遗传毒性。首先我们在黄丽华等描述的方法基础上稍加改进合成了2,4-二溴联苯醌。然后利用彗星实验检测DNA损伤,发现同对照组相比PBDEQ组细胞彗星拖尾明显,DNA损伤严重。利用微核实验检测染色体损伤,实验结果显示,同对照组相比PBDEQ组细胞微核率显著升高,PBDEQ严重损伤细胞染色体。利用8-OHdG释放实验检测DNA氧化损伤,发现PBDEQ刺激细胞内8-OHdG量显著升高,PBDEQ诱导细胞发生DNA氧化损伤。最后,利用western bolt实验和免疫荧光实验检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX表达,发现PBDEQ激活H2AX,使细胞内γ-H2AX表达明显升高,这一实验结果表明PBDEQ能诱导细胞DNA双链断裂,造成严重的DNA损伤。综合以上结果,PBDEQ诱导Hela细胞产生遗传毒性。第二部分:PBDEQ通过ROS激活PARP-1介导的parthanatos样细胞死亡。第一部分已经证明PBDEQ能诱发剧烈的DNA损伤,但是由不可逆的DNA损伤进一步带来的毒性效应还有待探究。在本章中我们首先利用CCK8实验,LDH释放实验检测PBDEQ对Hela细胞的毒性作用,结果表明PBDEQ能使细胞膜破损,导致细胞死亡。进一步实验发现PBDEQ刺激细胞产生大量的活性氧,诱导线粒体膜电位下降,这一结果表明PBDEQ诱导Hela细胞氧化损伤。利用Annexin V-FITC/PI双染实验以及TUNEL实验检测PBDEQ诱导细胞发生的具体死亡方式。我们发现细胞成Annexin V-FITC+/PI+双阳性表达且在TUNEL实验中成阳性表达,这一结果表明PBDEQ诱导的细胞死亡中存在区别于细胞凋亡和坏死的死亡方式。Parthanatos细胞死亡是近年来新发现的一种同DNA损伤密切相关的程序性死亡方式。利用western bolt实验和免疫荧光实验检测parthanato细胞死亡中标志性蛋白表达,实验显示在PBDEQ刺激下细胞内PARP-1、AIF和PAR呈倒U型表达,并且在PBDEQ浓度达到5μM时,PARP-1、AIF和PAR表达量达到峰值;实验结果显示PBDEQ能促进AIF由细胞质向细胞核转移。这些结果表明PBDEQ激活了parthanatos样细胞死亡通路。最后,我们发现抗氧化剂NAC以及PARP-1抑制剂3AB均能明显的抑制PBDEQ诱导的细胞内PARP-1、AIF、PAR的表达和AIF的核转移。这一结果表明ROS的产生以及PARP-1的激活介导了PBDEQ诱导发生的parthanatos样细胞死亡。然而,实验表明,caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK对PBDEQ诱导激活的PARP-1、AIF、PAR的高丰度表达以及AIF的核转移没有影响,这一结果证明PBDEQ诱导发生的parthanatos样细胞死亡具有非caspase依赖的特征。综上所述,PBDEQ具有遗传毒性。PBDEQ剧烈的DNA损伤作用诱导激活parthanato样细胞死亡通路,parthanatos样细胞死亡的发生受氧化应激调控,且PARP-1的过度激活在这个过程中起决定性作用。值得注意的是,PBDEQ激活的parthanatos样细胞死亡通路同细胞凋亡不同,其并不受caspase家族调控。第三部分:PBDEQ诱导铁自噬发生在本章中,我们首先发现PBDEQ也能激活PC12细胞中的氧化应激反应,并且大量的活性氧介导激活细胞自噬。接着通过western bolt实验检测自噬标志蛋白LC3-II、ATG5的含量,实验表明LC3-II、ATG5这三种蛋白在10μM的PBDEQ刺激下表达量显著升高,并且NAC能明显抑制PBDEQ诱导的LC3-II、ATG5表达。最后通过免疫荧光实验观察自噬溶酶体的形成,实验表明PBDEQ促进自噬溶酶体形成。综合以上结果,PBDEQ通过ROS介导细胞自噬的发生。已有研究表明铁自噬的发生需要NCOA4参与,NCOA4能特异性识别铁蛋白并介导铁蛋白同自噬溶酶体结合。首先通过免疫荧光实验观察铁蛋白是否在自噬溶酶体中表达,实验显示,PBDEQ诱导细胞内FTH、LAMP2、NCOA4以及LC3B共定位表达,PBDEQ诱导FTH同NCOA4结合,且促进铁蛋白向溶酶体中转移。通过western bolt实验发现PBDEQ诱导细胞内NCOA4的表达呈浓度梯度降低,FTH呈U型表达,在PBDEQ浓度为10μM时表达量最低。并且,PBDEQ诱导FTH和NCOA4的mRNA水平升高,这提示我们PBDEQ激活了铁自噬通路。自噬抑制剂（CQ）能抑制自噬溶酶体降解。实验发现CQ的加入能明显升高PBDEQ诱导的LC3-II水平,以及抑制PBDEQ介导的NCOA4、FTH的下调,这充分证明PBDEQ激活了细胞内铁自噬通路。利用瞬时转染NOCA4 SiRNA沉默NCOA4的表达,我们发现沉默NCOA4表达能抑制PBDEQ诱导的FTH降解,这一结果表明NCOA4蛋白在PBDEQ诱导的铁自噬发生过程中起重要作用。第四部分:PBDEQ诱导PC12细胞发生铁死亡,铁自噬的激活促进铁死亡的发生。在本章中,我们首先利用二价铁染色和二价铁荧光标记的方法检测二价铁离子含量,实验表明在PBDEQ暴露下细胞内铁离子含量升高。并且通过western bolt实验检测到PBDEQ促进铁转运蛋白（FPN）呈浓度梯度升高,二价铁转运蛋白（DMT）呈浓度梯度降低。结果表明PBDEQ促进细胞内铁离子含量升高。接着利用线粒体染色的方法发现PBDEQ诱导细胞内线粒体变小,并且通过Western bolt实验检测铁死亡相关蛋白的表达,实验结果表明PBDEQ诱导PX4表达下降,ASCL4表达升高。铁死亡抑制剂fer-1能显著抑制PBDEQ诱导的铁死亡。结果表明,PBDEQ诱导PC12细胞发生铁死亡。最后我们发现NAC抑制铁死亡相关蛋白的表达,PBDEQ诱导的铁死亡受ROS调控。并且PBDEQ诱导的铁自噬能促进铁死亡的发生。综上所述,PBDEQ诱导PC12细胞发生铁自噬和铁死亡,铁自噬的发生可以促进细胞铁死亡通路的激活。

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摘要

ABSTRACT

缩写符号对照表

第一章绪论

1.1 引言

1.2 多溴联苯醚

1.3 多溴联苯醚的代谢

1.4 2，4-二溴联苯醌

1.5 遗传物质损伤

1.6 Parthanatos细胞死亡

1.7 自噬

1.8 铁自噬

1.9 铁死亡

1.10 立题意义

第二章 PBDEQ诱导Hela细胞产生遗传毒性

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验试剂

2.2.3 常用溶液配制

2.3 实验方法

2.3.1 2，4-二溴联苯醌（PBDEQ）的合成与表征。

2.3.2 细胞培养

2.3.3 western blot实验

2.3.4 免疫荧光实验

2.3.5 彗星实验

2.3.6 微核实验

2.3.7 8-OHd G释放实验

2.3.8 统计分析

2.4 实验结果

2.4.1 合成并鉴定PBDEQ

2.4.2 PBDEQ损伤Hela细胞的DNA

2.4.3 PBDEQ损伤Hela细胞染色体

2.5 讨论

第三章 PBDEQ诱导细胞发生PARP-1 介导的parthanatos样细胞死亡研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 细胞存活率检测实验

3.3.2 活性氧检测实验

3.3.3 LDH释放实验

3.3.4 细胞凋亡检测实验

3.3.5 TUNEL实验

3.3.6 线粒体膜电位（MMP）检测实验

3.3.7 western bolt实验

3.3.8 免疫荧光实验

3.3.9 统计分析

3.4 实验结果

3.4.1 PBDEQ诱导Hela细胞产生细胞毒性

3.4.2 PBDEQ诱导Hela细胞发生氧化损伤

3.4.3 PBDEQ诱导Hela细胞发生parthanatos样细胞死亡

3.4.4 PBDEQ诱导Hela细胞发生的parthanatos样细胞死亡依赖于ROS产ROS产生和PARP-1 的激活

3.4.5 PBDEQ诱导Hela细胞发生的parthanatos样细胞死亡不依赖于caspasecaspase家族

3.5 讨论

第四章 PBDEQ诱导铁自噬发生

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验试剂

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养

4.3.2 western blot实验

4.3.3 SiRNA转染

4.3.4 免疫荧光实验

4.3.5 谷胱甘肽（GSH）含量检测实验

4.3.6 ROS检测实验

4.3.7 荧光定量PCR实验

4.3.8 数据分析

4.4 实验结果

4.4.1 PBDEQ诱导自噬发生

4.4.2 PBDEQ通过ROS介导自噬的发生

4.4.3 PBDEQ通过诱导自噬降解铁蛋白激活铁自噬通路

4.4.4 PBDEQ介导发生的铁自噬需要NCOA4参与

4.5 讨论

第五章 PBDEQ诱导铁死亡发生

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 实验仪器

5.2.2 实验试剂

5.3 实验方法

5.3.1 细胞存活率检测实验

5.3.2 Western blot实验

5.3.3 二价铁离子染色实验

5.3.4 二价铁离子检测实验

5.3.5 PI染色实验

5.3.6 线粒体染色实验

5.4 实验结果

5.4.1 PBDEQ诱导细胞内铁离子含量升高

5.4.2 PBDEQ通过ROS诱导PC12细胞发生铁死亡

5.4.3 PBDEQ诱导的铁自噬促进铁死亡的发生

5.5 讨论

全文总结

参考文献

致谢

作者攻读硕士学位期间已发表科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董文静

导师: 宋杨

关键词: 多溴联苯醌,损伤,细胞死亡,铁自噬,铁死亡

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 西南大学

分类号: X171.5

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多溴联苯醌诱导parthanatos样细胞死亡、铁自噬和铁死亡的发生以及毒性机制分析

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