兔脾脏成纤维型细胞RS17-2的建系及RHDV基因组SYBR Green qRT-PCR检测方法的建立

论文摘要

兔病毒性出血症（RHD）也被称为兔瘟。兔瘟是一种急性的、败血性的、高度传染性及高致死性的疾病,以兔全身实质性脏器出血为主要临床特征。兔出血症病毒（RHDV）为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5 Kb。目前,对于该RHDV尚无一个系统性基因组的监测方法与稳定的培养细胞系统,严重影响着RHDV的细胞侵染机理和防控等方面的研究。因此本文建立了RHDV基因组SYBR Green荧光定量RT-PCR的检测方法和兔脾脏源细胞建系,并进行建系细胞的RHDV初步感染试验,具体内容如下:1、根据RHDV的基因结构,在本文中,设计七对引物对本试验室保存的RHDV SCH07株基因组进行扩增。通过优化的最佳反应条件,建立了一组RHDV基因组的SYBR Green荧光定量RT-PCR的检测方法。再对其灵敏度、特异性、重复性试验进行了检测。该方法与兔巴氏杆菌,兔沙门氏菌,兔大肠杆菌和RHDV b无交叉反应,最小检测值为104拷贝/μL,批内和批间的变异系数均小于3%。结果表明,该方法具有灵敏度高,特异性强,稳定性好,精度高和快速检测的优点。2、在培养乳兔原代细胞的过程中,从脾脏组织中分离出一株成纤维样细胞,在原代细胞的培养过程中在其表面形成一层与其形态不同的细胞,并且生长速度快于原代细胞,通过细胞分离法将该株细胞从原代细胞中分离出来并将其命名为RS17-2。通过对RS17-2细胞传代培养条件优化、细胞标志性蛋白检测、细胞生长曲线、细胞核型等进行测定,以对细胞的生长特性以及生物学特性进行研究。结果显示该细胞系具有血清依懒性、成纤维细胞标志性蛋白检测阳性、具有正常的核型,且目前细胞传至150代仍可稳定生长。这为RHDV感染机制相关研究提供了细胞材料。3、用RHDV SCH07株对RS17-2细胞系进行感染以及SCH07株RNA在该细胞系转染研究,感染后观察细胞的CPE并收取细胞利用建立的荧光定量方法进行检测。该细胞在首次感染时细胞出现CPE,但是随着继续盲传,细胞CPE减弱,荧光定量检测病毒核酸含量随着传代次数增多而减少,盲传第6次后细胞病毒核酸检测阴性;RNA转染该细胞系后,随着时间延长,细胞皱缩变多,但时间梯度之间细胞的CPE差别不明显,荧光定量检测细胞病毒核酸含量阳性。为进一步RHDV对细胞内部的侵染机制研究提供了科学参考。

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第一章文献综述

1 RHDV的研究进展

1.1 病原学

1.2 RHDV的结构蛋白

1.3 病毒非结构蛋白

1.4 RHDV遗传演变方面的研究进展

1.5 RHDV分离培养的探索

2 细胞培养学及细胞库的建立

2.1 细胞系、细胞株和克隆

2.2 二倍体和细胞的转化

2.3 细胞库建设概况

3 细胞永生化

3.1 端粒

3.2 端粒酶

3.3 端粒酶在细胞永生化中的作用

3.4 端粒酶在细胞永生化中的优越性

4 研究背景与目的

第二章 RHDV基因组SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1 材料

1.1 病料、菌种和毒株

1.2 试剂

1.3 仪器与设备

1.4 引物设计及合成

2 方法

2.1 病毒RNA提取

2.2 病毒RT-PCR

2.3 PCR产物纯化回收

2.4 产物的连接及转化

2.5 重组T载体鉴定

2.6 SYBR Green实时荧光定量RT-PCR标准品的制备

2.7 SYBR Green实时荧光定量PCR反应条件的优化

2.8 SYBR Green荧光定量PCR标准曲线的绘制

2.9 敏感性及特异性检测

2.10 重复性试验

2.11 临床样品的检测

3 结果

3.1 RHDV SCH07基因组RT-PCR扩增

3.2 测序结果

3.3 标准质粒浓度的测定

3.4 退火温度的优化

3.5 引物浓度优化

3.6 荧光定量RT-PCR标准曲线

3.7 敏感性限度试验

3.8 特异性试验

3.9 重复性试验

3.10 临床样本检测结果

4 分析与讨论

第三章兔脾脏成纤维细胞的建系

1 材料

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器与设备

2 方法

2.1 乳兔脾脏原代细胞的培养

2.2 乳兔脾脏细胞的传代培养

2.3 乳兔脾脏细胞的保存

2.4 乳兔脾脏细胞的复苏

2.5 细胞活性的检查

2.6 细胞微生物污染的检测

2.7 28S rRNA基因序列测定和比对分析

2.8 MTT法检测血清依赖性

2.9 乳兔脾脏细胞标志性蛋白的免疫荧光检测

2.10 RS17-2 细胞生长曲线的测定

2.11 乳兔脾脏细胞细胞染色体观察

3 结果

3.1 兔原代细胞观察

3.2 原代细胞的分化

3.3 RS17-2 细胞的传代

3.4 RS17-2 细胞的冻存与复苏

3.5 细胞活性的检测

3.6 微生物污染检测

3.7 28SrRNA基因序列测定和比对分析

3.8 MTT法检测血清依赖性

3.9 RS17-2 细胞标志性蛋白的免疫荧光检测

3.10 RS17-2 细胞的生长曲线

3.11 RS17-2 细胞的染色体观察

4 分析与讨论

第四章 RHDV SCH07 株对RS17-2 细胞内的侵染试验

1 材料

1.1 病料、细胞

1.2 试剂

1.3 仪器

2 方法

2.1 RHDV SCH07 株病毒匀浆液的制备

2.2 SCH07 株感染RS17-2 细胞系以及盲传

2.3 SCH07 株病毒RNA转染RS17-2 细胞系

3 结果

3.1 SCH07 株感染RS17-2 细胞系以及盲传

3.2 RHDV病毒RNA转染的检测

4 分析与讨论

结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 罗怡琳

导师: 杨泽晓

关键词: 兔出血症病毒,成纤维型细胞,荧光定量,细胞感染

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

基金: 国家自然科学基金项目青年科学基金项目(31402222),四川省科技支撑计划(2016N2002)

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000905

总页数: 80

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