水稻CRISPR-Cas9-UBA编辑系统构建及应用

论文摘要

成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其关联蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）构成的CRISPR-Cas系统是存在于大多数细菌与所有古菌中的一种后天免疫系统,通过对外来DNA的识别、整合、表达、干扰来对抗入侵的质粒或噬菌体,目前已被广泛应用于基因定向敲除、添加、激活或抑制等遗传操作中。基于Ⅱ型CRISPR系统发展起来的CRISPR-Cas9已经成为继第一代锌指核酸酶（ZFN）和第二代转录激活因子样核酸酶（TALEN）之后的第三代基因编辑系统。与ZFN和TALEN基因编辑工具相比,CRISPR-Cas9系统具有剪切高效、构建简单及成本低廉等优势,但其在编辑的过程中仍存在靶基因的编辑效率差异大,部分靶位点编辑效率低下等问题。为了提高CRISPR-Cas9系统的编辑效率,本研究对实验室前期开发的单一转录单元CRISPR-Cas9（Single transcript unit CRISPR-Cas9）植物基因组编辑系统进一步改造优化,通过将Cas9蛋白与不同泛素相关结构域（Ubiquitin Associated domain,UBA）UBA1、UBA2、UBA3分别融合,构建CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统。进一步选择三个水稻内源基因的不同靶位点构建CRISPR-Cas9-UBA定向编辑表达载体,利用原生质体瞬时转化体系和农杆菌介导稳定遗传转化体系分别检测其剪切活性及编辑效率,从而评价不同UBA结构域对Cas9蛋白活性及编辑效率的影响。本研究的主要内容及结果如下:1.通过对不同泛素相关结构域的比较,筛选来源拟南芥的UBA1、UBA2、UBA3结构域,进行水稻密码子的偏好优化,以本实验室CRISPR-Cas9系统的pTX172为骨架载体,构建获得三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统载体pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03。2.选择与水稻白化、矮化、卷叶表型相关的三个内源基因OsPDS、OsDEP1、OsROC5为报告基因,以前期实验中编辑效率相对较低的OsPDS-sgRNA01、OsPDS-sgRNA02、OsDEP1-sgRNA02、OsROC5-sgRNA01四个靶位点为研究对象,基于三个CRISPR-Cas9-UBA系统pYLJ01、pYLJ02、pYLJ03及对照CRISPR-Cas9系统pTX172分别构建针对以上四个靶位点的16个定向编辑表达载体。3.通过PEG介导的水稻原生质体瞬时转化体系,对融合不同UBA结构域的Cas9蛋白的剪切活性进行了初步检测,结果显示与对照组CRISPR-Cas9相比,三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统在四个靶位点均有剪切活性,说明UBA1、UBA2、UBA3结构域对Cas9蛋白的剪切活性没有影响,可以用于进一步的基因编辑效率研究。4.进一步以OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02位点为研究对象,在日本晴水稻品种中进行农杆菌介导的稳定遗传转化,对再生的转基因植株靶位点进行突变检测、表型分析及突变效率比较,用来评价CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统的有效性、稳定性和编辑效率差异。基于PCR-RFLP和测序的基因型分析,三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统对水稻內源基因的剪切位点与对照CRISPR-Cas9系统一致,大部分是双等位基因或其中一个等位基因在PAM邻近端3-4位置处1bp碱基的缺失或插入。说明融合UBA1、UBA2、UBA3结构域对Cas9蛋白的剪切作用模式没有明显的影响。对突变体植株表型分析显示:对照CRISPR-Cas9系统和三个CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统诱导产生的突变植株表型没有明显差异。这表明CRISPR-Cas9-UBA基因编辑系统在诱导产生突变的作用机制上与CRISPR-Cas9系统没有明显差异,可以用于基因定向编辑及突变体创制。5.与CRISPR-Cas9编辑系统对比,三个CRISPR-Cas9-UBA系统在OsPDS-sgRNA01和OsDEP1-sgRNA02两个靶位点上均能有效引导基因突变,且基因编辑效率都有显著提高。其中,融合UBA2结构域的CRISPR-Cas9-UBA2系统定向编辑效率最高。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨丽佳

导师: 郑雪莲

关键词: 基因组定向编辑,水稻

来源: 电子科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农作物

单位: 电子科技大学

分类号: Q78;S511

总页数: 63

文件大小: 3137K

下载量: 103

相关论文文献

• [1].碱基编辑系统在遗传性疾病治疗中的应用[J]. 药学学报 2020(07)
• [2].全媒体时代广电编辑系统中“云”编辑的辅助作用[J]. 电视指南 2017(09)
• [3].基于Web2.0的网络课程交互协同编辑系统设计[J]. 现代商贸工业 2014(22)
• [4].ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因编辑系统及其在农业和林业上的应用展望[J]. 科学中国人 2016(35)
• [5].两种新型CRISPR/Cas基因编辑系统问世[J]. 科学家 2016(18)
• [6].徐勇改的最后一篇稿[J]. 中国记者 2019(12)
• [7].广播电视台新闻云编辑系统的建设[J]. 广播与电视技术 2020(01)
• [8].大洋D3-Weather5600A非线性影视编辑系统在地市级天气预报制作中的应用[J]. 科技创新导报 2011(21)
• [9].《地质科技情报》正式启用网上投稿编辑系统[J]. 地质科技情报 2010(05)
• [10].《资源与产业》网上投稿编辑系统正式开通[J]. 资源与产业 2008(06)
• [11].如何建设协同编辑系统[J]. 出版参考 2014(10)
• [12].建立宏观编辑系统之我见[J]. 辽宁广播电视大学学报 2012(01)
• [13].关于启用网上投稿编辑系统的通知[J]. 中共四川省委党校学报 2018(04)
• [14].关于启用网上投稿编辑系统的通知[J]. 中共四川省委党校学报 2019(01)
• [15].出版社数字编辑系统管见[J]. 科技与出版 2016(11)
• [16].新奥特多通道收录编辑系统在《创业内蒙古》中的应用[J]. 数字传媒研究 2015(03)
• [17].坚持自主创新 华傲精创推一体化编辑系统[J]. 中国传媒科技 2008(11)
• [18].使用大洋非线性网络编辑系统的若干研究[J]. 数字通信世界 2020(04)
• [19].简单行编辑系统的实现[J]. 信息与电脑(理论版) 2010(02)
• [20].《药物分析杂志》编辑部声明[J]. 药物分析杂志 2011(09)
• [21].《中国医学影像技术》编辑部重要公告[J]. 中国医学影像技术 2010(08)
• [22].关于启用网上投稿编辑系统的通知[J]. 中共四川省委党校学报 2019(02)
• [23].关于启用网上投稿编辑系统的通知[J]. 中共四川省委党校学报 2018(03)
• [24].消息[J]. 中国医学影像技术 2013(08)
• [25].Avid旗舰编辑系统进一步拓展开放性工作流程的创新[J]. 影视制作 2011(03)
• [26].关于网上投稿 编辑系统开发的思考——以“中国期刊在线”软件开发为例[J]. 中共贵州省委党校学报 2008(03)
• [27].科技期刊标准化自动编辑系统研究与实现[J]. 中国科技期刊研究 2008(05)
• [28].宁波晚报打造纸媒“掌上编辑部”[J]. 新闻实践 2012(08)
• [29].碱基编辑系统研究进展[J]. 遗传 2019(09)
• [30].CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物中的研究进展[J]. 中国农学通报 2015(12)

标签：基因组定向编辑论文;  水稻论文;