魏君[1]2003年在《胚乳中不表达基因组片段的分离及磷代谢的品种差异分析》文中指出对水稻进行品质改良，转基因技术是目前被广泛使用的一种行之有效的方法。在外源基因上连上水稻自身的启动子不仅能够实现外源基因在受体体内的定向表达，还从某种程度上缓解了外源基因在受体体内表达沉默的问题。在本实验中利用本室构建的平衡化明恢63全生育期cDNA文库点阵膜来进行在胚乳中特异性不表达的cDNA克隆的筛选，分别用来自水稻不同器官中的RNA反转录制成放射性cDNA探针与cDNA点阵杂交，通过比较不同探针与点阵杂交所得到的杂交图像，得到了一批在胚乳中特异性不表达的克隆，对它们进行Northern检测和序列分析，从中挑选出编码水稻光系统Ⅱ10KDa蛋白前体的cDNA克隆EI#44P17来制备探针筛选58N BAC文库，对得到的阳性BAC119H12进行进一步的分析，从中分离得到长度为6.2 kb与EI#44P17同源的基因组片段，对其进行Shotgun测序，根据测序结果利用GENESCAN和GeneFinder对启动子分别进行了预测，两者的预测结果一致，都包含了编码该前体蛋白的完整ORF。 本实验的另一部分是通过cDNA芯片对两种低磷情况下的敏感材料(中早18和Lagrue)进行低磷胁迫后的表达分析，找到二者间的表达差异。从叁叶期开始进行低磷胁迫处理，分别于胁迫后不同时间段不同器官进行取样并抽提RNA。来自不同材料和不同器官，取于不同时间的RNA分别与对应的非胁迫处理材料作为一组探针标记上不同的荧光标记来进行芯片杂交，芯片上包括明恢63全生育期cDNA文库和5种消减杂交cDNA文库，共计5760个unique-gene。“黄点实验”分析决定差异表达的极限值分别为1.78和0.55。来自不同材料，不同时期和部位的探针经过芯片杂交后得到的差异表达的克隆数各不相同。部分由芯片杂交得到的差异克隆经过Northern杂交得到了进一步的验证。对这些克隆进行序列分析发现它们编码了各种功能的酶和蛋白，涉及到植物生理生化的各个方面，其中部分已经被报道与低磷胁迫有关。对低磷胁迫消减杂交文库的序列分析也得到了相似的结果。根据Northern杂交和序列分析的结果，可以找到两种材料之间的表达差异：首先，中早18对低磷反应较Lagrue激烈；其次，中早18具有在一定时间内持续产生有机酸的机制，而在Lagrue中没有检测到；最后，低磷胁迫能够造成氮素代谢不正常，Lagrue受低磷胁迫的影响要远大于中早18，Lagrue中许多参与氮代谢的酶的表达大大降低。这些基因表达的差异很可能是造成中早18和Lagrue在低磷条件下生长发育状况，结实率以及干物质积累等重要生理参数不同的原因。
张利娜[2]2015年在《OsCDPK12的启动子分析及水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作研究》文中研究指明CDPKs(calcium-dependent and calmodulin-independent protein kinases),全称依赖钙而不依赖钙调素的蛋白激酶,是一类仅在植物和部分原生生物中存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在介导植物生长发育信号和逆境信号转导中具有重要作用。目前在水稻中已发现31个CDPKs基因,但功能明确的只有少数几个基因,其它大多数基因的功能有待进一步研究。本项研究是针对Os CDPK12和Os CDPK24两个基因开展的。本研究获得的主要研究结果如下:1.Os CDPK12的启动子分析1.1通过PCR技术从日本晴(Oryza sativa L ssp.Japonica)基因组上克隆到Os CDPK12上游2109 bp的启动子区域,命名为12P,将其融合报告基因β-glucuronidas(GUS),转化水稻中花11(Oryza sativa L ssp.Japonica),组织化学染色结果显示主要在根茎过渡区、茎节、花药、种子中表达;之后对该启动子进行5'端缺失分析,构建8个融合报告基因GUS的缺失载体,对其转基因水稻植株的研究发现,除12P687外,各个缺失启动子均能驱动GUS基因在根茎过渡区、幼穗花药、枝梗、茎节、种子中表达,而在叶、叶鞘和根中不表达,12P687却能驱动GUS基因在各个组织中表达,表现为组成型表达的特征。1.2对比分析不同缺失启动子转基因植株各组织的染色结果,可以看出,在-966 bp~-687 bp区域,存在关键的负调控元件;-687 bp~-472 bp区域,具有正向调控的顺式作用元件。1.3 GUS活性的定量测定结果显示,12P687启动子在叶和叶鞘组织中的活性约为35S启动子活性的1/2,而根中12P687启动子的活性约为35S启动子活性的1/3。1.4对不同缺失启动子的转基因植株进行了低温、低氮和高盐胁迫处理,发现12P1828的转基因材料经冷胁迫后在叶片中表达上升,而12P687的转基因材料经高盐胁迫后在根中表达下降。2.水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作研究2.1克隆了水稻GRXs的22个基因,分别是:Os GRX3、Os GRX4、Os GRX5、Os GRX6、Os GRX8、Os GRX9、Os GRX11、Os GRX12、Os GRX14、Os GRX15、Os GRX16、Os GRX17、Os GRX19、Os GRX20、Os GRX21、Os GRX22、Os GRX24、Os GRX25、Os GRX26、Os GRX27、Os GRX28、Os GRX29。并将其分别构建到AD载体上,获得22个重组载体。通过自激活检测,发现均无潜在激活基因转录活性。2.2 Os CDPK24与水稻GRXs的蛋白互作验证结果表明Os GRX8、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28分别与Os CDPK24-1的蛋白是有互作的,而Os GRX8、Os GRX14、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28分别与Os CDPK24-2的蛋白也是互作的。2.3分别克隆水稻CDPKs序列Os CDPK2、Os CDPK20、Os CDPK21、Os CDPK23、Os CDPK25、Os CDPK29全长序列及截短序列。并将其分别构建到BD载体上获得重组载体。通过自激活检测,发现除Os CDPK23-1外均无潜在激活基因转录活性。2.4水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作验证结果表明Os CDPK4、Os CDPK12、Os CDPK20、Os CDPK21、Os CDPK25、Os CDPK29与水稻GRXs蛋白均无互作。2.5通过DNAMAN工具对Os GRX8、Os GRX14、Os GRX16、Os GRX26、Os GRX28的氨基酸序列进行了多重序列比对,结果发现这些序列并没有明显的保守区域;然而针对Os GRX8、Os GRX26、Os GRX28这3个的氨基酸序列进行多重序列比对,发现这些序列存在明显的保守区域。
参考文献：
[1]. 胚乳中不表达基因组片段的分离及磷代谢的品种差异分析[D]. 魏君. 华中农业大学. 2003
[2]. OsCDPK12的启动子分析及水稻CDPKs与GRXs的蛋白互作研究[D]. 张利娜. 华中农业大学. 2015