李志茹[1]2004年在《拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氯氟氰菊酯免疫检测技术研究》文中研究说明农药残留免疫检测技术是国内外小分子快速检测的重要内容。本文针对拟除虫菊酯类农药制备通用抗体。以拟除虫菊酯类农药的中间体——间苯氧基苯甲酸为半抗原，用活性酯法在间苯氧基苯甲酸的羧基末端偶联载体蛋白BSA作为免疫抗原，用混合酸酐法在其羧基末端偶联载体蛋白OVA作为ELISA反应的包被抗原。用UV-2401Pc型号的紫外分光光度计对合成的人工抗原、BSA、OVA以及半抗原进行全波长扫描，鉴定人工抗原偶联成功与否，经过扫描鉴定，偶联物在280nm处的紫外吸收峰型与单一蛋白吸收峰型的变化比较，可以初步判断偶联成功。 用上述制备的人工抗原PBA-BSA作为免疫抗原，制备#0631，#0629，#0977抗血清。抗血清效价测定依次达到1：204800，1：819200；1：409600。用#0629血清确定抗原抗体工作浓度，抗原工作浓度为6μg／mL，抗体工作浓度为血清稀释6000倍。在此工作浓度下，用9种拟除虫菊酯进行交叉测试，抗体可以识别高效氯氟氰菊酯，氰戊菊酯，氟菊酯和百树菊酯等几种农药。以高效氯氟氰菊酯为研究对象，检测的标准曲线方程为Y=-0.8129X+2.3439，R~2=0.9965.I_(50)为0.76mg／ml。检测线性范围1-10000μg／mL。检测精确度用微量板的批内和批间误差表示。批内变异系数为CV=4.7％，批间平均变异系数为CV=4～7.1％。 用高效氯氟氰菊酯对ELISA检测条件优化，抗原工作浓度为6μg／mL，抗体工作浓度血清稀释6000倍。反应体系封闭液1％OVA，封闭时间2h，离子强度0.2～0.3M，有机溶剂(甲醇，丙酮)浓度≤10％，pH值的适宜范围为7～9，反应温度37℃，时间1h，TMB显色时间10Min。
韩爱华[2]2007年在《氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯免疫分析化学研究》文中研究表明本实验以氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯为研究对象,合成了氯氰菊酯半抗原Cyp-Hp_1和氟氯苯氰菊酯半抗原Flu-Hp_2。采用活性酯法将半抗原与载体蛋白BSA和OVA共价偶联,制备人工抗原,经紫外分析确定偶联成功,以Cyp-Hp_1-BSA和Flu-Hp_2-BSA为免疫原免疫新西兰白兔,分别获得了针对氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯的特异性抗血清。间接ELISA法测定抗血清的中点效价为1.6×104,双向琼脂扩散法测定抗血清的效价为1/16。以硫酸铵分步盐析法分离抗血清中的抗体并冻干得抗氯氰菊酯抗体Ab_1和抗氟氯苯氰菊酯抗体Ab2。分别用活性酯法和混合酸酐法制备了酶标半抗原(Cyp-Hp_1-HRP和Flu-Hp_2-HRP),酶标记物既保持了免疫化学特性,又保持了酶活性,可用于免疫化学分析。进一步研究了pH值、离子强度和有机溶剂在包被抗体-酶标半抗原(E-H)直接竞争ELISA中对氯氰菊酯与Ab_1亲和作用的影响。结果表明:包被介质pH为7.2时,固相载体对Ab_1的吸附性最好;反应介质pH为7.0时,Ab_1与氯氰菊酯的亲和作用最强;离子强度在一定范围内增大会提高Ab_1与氯氰菊酯的亲和力;乙腈和丙酮对氯氰菊酯免疫分析结果的影响要大于甲醇。成功建立了氯氰菊酯直接竞争酶联免疫吸附分析法。方阵试验确定了Ab_1最佳包被浓度为6μg/mL,酶标半抗原(Cyp-Hp_1-HRP)最佳稀释度为64000倍。在优化条件下,建立了氯氰菊酯的标准抑制曲线,回归方程I=0.1919LogC+0.5618,R~2 = 0.9913,线性范围为100～0.01μg/mL,抑制中浓度IC_(50)= 0.461μg/mL,IC_(20)=12ng/mL, RSD=17.26%(n=5)。在空白青菜样品中分别添加氯氰菊酯标样,使样品中氯氰菊酯的含量分别为0.5 mg/kg和5mg/kg两个水平。添加样品用丙酮提取,E-H直接竞争ELISA法测定,重复5次。氯氰菊酯添加浓度为0.5mg/kg水平时,回收率80.29%～89.20%,RSD为4.35%;氯氰菊酯添加浓度为5mg/kg水平时,回收率89.68%～120.78%,RSD为11.88%。说明E-H直接竞争ELISA法能满足氯氰菊酯残留分析的要求。成功建立了氟氯苯氰菊酯直接竞争酶联免疫吸附分析法。方阵试验确定了Ab2最佳包被浓度为6μg/mL,酶标半抗原(Flu-Hp_2-HRP)最佳稀释度为384000倍。建立了氟氯苯氰菊酯的标准抑制曲线,回归方程I=0.1998LogC+0.6988,R~2 = 0.9996,线性范围为10～0.01μg/mL,抑制中浓度IC_(50)= 0.101μg/mL,IC_(20)=3ng/mL, RSD=15.42%(n=5)。
参考文献：
[1]. 拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氯氟氰菊酯免疫检测技术研究[D]. 李志茹. 南京农业大学. 2004
[2]. 氯氰菊酯和氟氯苯氰菊酯免疫分析化学研究[D]. 韩爱华. 扬州大学. 2007