李纪锁[1]2003年在《番茄中番茄红素含量影响因素及遗传的初步研究》文中认为本实验采用分光光度法，测定分析了50个不同基因型鲜食番茄果实的番茄红素含量，温度和光照对番茄果实番茄红素含量的影响，并通过双列杂交和六世代联合分析法研究了鲜食番茄果实中番茄红素的遗传规律。结果表明： (1)鲜食番茄果实内番茄红素含量在不同基因型间存在显着差异。樱桃番茄品种的番茄红素含量在1702μg／100g～6389μg／100g(鲜重)之间，平均值为2861μg／100g。而大果型材料果实内番茄红素含量在979μg／100g～3408μg／100g之间，平均为1893μg／100g。 (2)随着番茄果实成熟度的增加，果实内番茄红素含量迅速增加，但以坚熟期增加较慢；在春夏季，同一品种在不同设施条件下以纱棚中含量最高，日光温室中含量最低。 (3)番茄果实内番茄红素含量随着光照强度的减弱而降低；高温和低温均不利于粉红色和大红色番茄品种番茄红素的合成。 (4)番茄红素的一般配合力在-0.395～0.242之间，其中以亲本1、4、5最高，特殊配合力在-0.315～0.233之间，其中S_(25)的特殊配合力较高。广义遗传力为91.70％，狭义遗传力为66.13％，其遗传符合加性—显性模型。 (5)番茄红素的遗传符合一个主基因和加性—显性—上位性多基因模型，主基因遗传力在B_1、B_2和F_2分别为6.85％、34.78％和58.33％，多基因遗传力在B_1、B_2和F_2分别为58.48％、30.69％、0。
严玉坤[2]2009年在《高番茄红素性状的遗传分析及分子标记》文中进行了进一步梳理番茄红素是番茄重要的品质指标之一。番茄红素含量越高,品质越好。最近研究还表明番茄红素具有降低人类患某些恶性肿瘤风险的保健功能。因此,通过遗传改良,增加果实番茄红素的含量成为番茄品质育种的重要目标。本试验利用高番茄红素含量的07009与低番茄红素含量的07922番茄品种为试验材料,以该组合的F2群体作为作图和遗传规律鉴定群体,对亲本和F2群体分离后代的番茄红素含量进行了鉴定,采用SSR分子标记构建遗传连锁图谱,利用复合区间定位方法对番茄红素含量性状进行QTL定位。主要研究成果如下:1.对番茄中番茄红素含量进行遗传分析,结果表明:番茄红素含量在F2分离群体中,呈现连续性变异,χ2测验均不显着。据此判断番茄红素含量属于数量性状。ABC尺度遗传检验表明,番茄红素含量符合加性-显性遗传模型。番茄红素的狭义遗传力为44.47%,广义遗传力为75.8%。2.应用SSR分子标记技术筛选得到与番茄红素含量相关的12个SSR标记。利用复合区间作图法在第9连锁群上检测到2个与番茄红素含量相关的QTLs。Qchl1与分子标记SSR237、T24紧密连锁,与二者分别相距7.0 cM和10.1 cM变异贡献率为7.23%。Qchl2与分子标记T24、FR119紧密连锁,与二者分别相距12.5 cM和6.1 cM,变异贡献率为10.64%。3.通过对30份种质资源的分析鉴定,将30份番茄种质资源分成2组,高番茄红素含量组和低番茄红素含量组的分组准确率均为100%,由此可初步证明,对番茄红素含量性状QTL位点的SSR标记结果真实可靠。
张映曈[3]2016年在《卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究》文中研究表明番茄红素是异戊二烯类化合物,属于类胡萝卜素的一种,是自然界最强的抗氧化剂之一,具有抗癌防癌、防治心血管疾病等多种生理功能。为了满足番茄红素在医药及营养领域的应用需求,通过生物技术大量生产高纯度、安全的番茄红素成为番茄红素合成技术的发展趋势。本论文在以类胡萝卜素为主要次级代谢产物的丝状真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides)基础上,挑选产量较高的突变株为出发菌株,从改造番茄红素合成途径及调控路径两方面着手,通过分子生物学等手段获得了一株番茄红素高产菌株,并对其发酵条件进行初探,进一步提高了番茄红素产量。论文的主要研究结果如下:(1)解除卷枝毛霉类胡萝卜素合成途径的负调控因子crg A,提高卷枝毛霉类胡萝卜素合成:通过敲除卷枝毛霉MU206和MU218中限制类胡萝卜素合成的调控基因crg A,共获得了5株Δcrg A菌株,类胡萝卜素的主要成分(β-胡萝卜素)含量提高了4.8~47.6倍。相较于MU206,以MU218为背景构建的Δcrg A菌株类胡萝卜素产量提高更为显着,其中含量最高的是MU606,其β-胡萝卜素含量在黑暗和光照条件下分别达到3.00 mg/g和4.01 mg/g,是初始菌株MU218的47.6倍和5.4倍,是用于构建卷枝毛霉番茄红素高产菌株的潜力菌株;同时对卷枝毛霉MU206和MU218中潜在的类胡萝卜素调控机理进行了初步探索,发现MU218中存在类似于Crg A途径的新调控路径。(2)阻断番茄红素环化为β-胡萝卜素的反应,构建番茄红素生产菌株:在上述重组菌株MU606基础上,同时采用定点突变和化学诱变两种方式使番茄红素环化酶失活,最终获得叁株红色突变株。测序结果显示叁株突变株中编码番茄红素环化酶的car RP基因均发生了突变。突变导致MUt1和MUt2番茄红素环化酶活力部分丧失,而突变株MUt3的番茄红素环化酶则完全失活,其番茄红素含量在黑暗与光照条件下分别达到1.90 mg/g和3.64 mg/g,与MU606相比提高了30.6倍和21.4倍。根据不同突变株的类胡萝卜组成及含量对卷枝毛霉番茄红素环化酶的催化机制进行了研究:其蛋白结构中两个重复的R domain结构域分别负责γ-胡萝卜素到β-胡萝卜素和番茄红素到γ-胡萝卜素的反应,且第1个R domain的功能依赖于第2个R domain的作用。此外,发现番茄红素含量较高的菌株中存在反馈抑制效应。(3)强化番茄红素合成途径限速步骤,增加目的产物代谢流:首先通过转录组分析推测HMG-Co A还原酶(HMGr)是番茄红素合成途径的限速酶,在突变株MUt3基础上成功同源过量表达编码HMGr的叁个拷贝(hmgr1,hmgr2,hmgr3),揭示了HMGr在卷枝毛霉番茄红素合成过程中的作用:其中hmgr2、hmgr3的过量表达使番茄红素含量提高了2倍左右,说明其编码的HMGr是番茄红素合成途径的限速酶;而hmgr1的过表达并未造成番茄红素含量的变化,暗示其编码的HMGr可能参与了其他萜类物质的合成。本章获得了一株高产番茄红素的卷枝毛霉菌株MUhr3-1,在黑暗和光照条件下番茄红素含量分别达到3.75 mg/g和7.16 mg/g,是对照菌株的2倍。(4)抑制竞争代谢途径(脂肪酸合成途径),为番茄红素合成增加底物:首先通过氮限制培养基考察了卷枝毛霉中脂肪酸和类胡萝卜素积累的关系:脂肪酸和类胡萝卜素的合成均受氮源的调控,积累同步,存在竞争关系;并通过转录组分析发现在类胡萝卜素产量较高的卷枝毛霉菌株中,编码脂肪酸合酶和乙酰辅酶A羧化酶(FAS和ACC)的基因转录水平较低,进一步证明脂肪酸与类胡萝卜素合成的竞争关系;最后在MUhr3-1基础上分别构建了FAS和ACC的RNAi菌株,通过下调FAS和ACC的表达水平使番茄红素的含量分别提高了14%~43%和13%~46%,然而菌体生长受到影响;为避免抑制FAS和ACC的表达导致的菌体生长受阻,在菌体积累完成后添加FAS和ACC抑制剂(浅蓝菌素、棕榈油、红花籽油和橄榄油),进一步提高了番茄红素的含量。其中添加浅蓝菌素和棕榈油最高可使番茄红素含量提升至11.10和11.55 mg/g。(5)优化番茄红素合成发酵培养基碳源、氮源,提高番茄红素产量:以重组卷枝毛霉MUhr3-1为研究对象,考察碳源浓度、氮源的种类和浓度对番茄红素产量的影响,结果表明葡萄糖浓度为80 g/L、以大豆豆粕为氮源且浓度为25 g/L时番茄红素产量最高,与初始发酵条件相比提高了2.5倍。在发酵罐中进行扩大培养,发酵过程中添加棕榈油作为ACC抑制剂,发酵至120 h时番茄红素含量达到12.77±1.79 mg/g,与出发菌株MU218相比提高了386倍。同时番茄红素单位体积产量达到261.28±9.62 mg/L,是迄今为止报道的卷枝毛霉番茄红素最高产量的5倍。成功实现了在卷枝毛霉中番茄红素的高效合成。
刘清华[4]2009年在《西瓜番茄红素的测定及遗传效应分析》文中研究说明本研究以67个西瓜材料为主要实验材料,运用分光光度法测其番茄红素含量。实验比较研究了不同取样部位、提取溶剂、提取温度、提取时间、成熟度以及不同的贮藏温度对番茄红素含量的影响;研究了不同瓤色、不同倍性、亲本、F_1和F_2代番茄红素含量之间的关系;并对含糖量与番茄红素含量的相关性进行了初步的研究。结果如下:1、利用分光光度法针对影响番茄红素提取效果的提取溶剂、波长、浸提温度、浸提时间、浸提溶剂体积和原料取样部位这些因素进行了比较分析。通过比较发现在西瓜果实的种子附近取样,加入30mL正己烷作为提取溶剂,置于温度35℃,转速为110r/min的振荡器上,避光振荡2h,用紫外分光光度计在503nm波长下测定其吸光度,是比较理想的方法。2、比较研究VS8-37、VS8-38不同成熟度的西瓜番茄红素含量,结果表明:西瓜番茄红素是随着果实进入适熟期而慢慢积累的,当果实完全发育成熟时,番茄红素的含量也达到最高值,随着果实的过熟番茄红素的含量又逐渐的下降。VS8-37、VS8-38番茄红素含量最高的时期是果实发育的第36d、34d,分别为5.398mg/100gFW、5.371mg/100gFW。对切开的西瓜果实进行5℃和—18℃两种不同的避光处理,贮藏期为8d,在贮藏期间,番茄红素的含量随着贮藏时间的延长而降低。在5℃的贮藏条件下,番茄红素在贮藏期间平均下降了23%;在—18℃的贮藏条件下番茄红素含量平均下降了31%。3、通过比较不同瓤色和不同倍性的西瓜番茄红素含量,结果表明:西瓜番茄红素的含量随着瓤色的加深而增加,所以西瓜果实发育成熟时的瓤色,可作为初步判断该时期番茄红素含量的表观依据。并从中筛选出番茄红素含量较高的材料S292、S171-1和S316,含量分别为6.372mg/100gFW、6.135mg/100gFW和5.978mg/100gFW。8个叁倍体西瓜材料番茄红素的平均含量为6.315mg/100gFW,其含量均高于双亲,差异达到显着水平。通过计算叁倍体西瓜的杂种优势,结果表明叁倍体西瓜均表现出正中亲优势率和正超亲优势率。4、通过计算叁种瓤色组合番茄红素含量的杂种优势,结果表明:在深红瓤×深红瓤组合中,有2个F_1的番茄红素含量表现出正中亲优势率和正超亲优势率;在深红瓤×粉红瓤的组合中,有3个F_1的番茄红素含量表现出正中亲优势率;在粉红瓤×粉红瓤组合中没有表现出杂种优势率。5、通过对S649×S631、S649×S555P、S555P×S631、S649×S661的F_2番茄红素的比较研究,结果表明这四个实验材料番茄红素的含量范围为1.622～7.136mg/100gFW,主要集中在4.000～6.000mg/100gFW。广义遗传力估算结果分别是83.05%、76.10%、79.89%、76.66%。6、通过对西瓜含糖量和番茄红素含量进行相关性分析,结果表明:西瓜含糖量和番茄红素含量之间无显着线性相关。
曲瑞芳[5]2006年在《番茄果实中番茄红素的遗传分析及与农艺性状的相关性研究》文中研究表明以西北农林科技大学园艺学院育种与品种资源课题组提供的22个番茄自交系为材料,采用分光光度法测定果实番茄红素含量,研究了果实番茄红素含量随果实发育的变化规律,以及果实中番茄红素含量与主要农艺性状和果实性状的相关性;并通过完全双列杂交配置25个组合,进行了番茄果实中番茄红素配合力分析,及其遗传参数的估算。主要结果如下:1.番茄果实中番茄红素的发育规律研究番茄果实中番茄红素含量随果实发育逐渐增加,红熟期番茄红素含量较变色期含量显着增加,变色期到红熟期是果实番茄红素合成的关键时期。不同果实颜色品种间比较,樱桃红色果实含量最高,黄色果实含量最低,且整个果实发育期含量变化不显着。果实颜色相同的樱桃番茄和普通番茄品种比较,樱桃番茄果实中番茄红素含量高于普通番茄。2.番茄果实中番茄红素含量与农艺性状的相关性研究各性状与番茄红素存在遗传相关,各性状之间也存在复杂的相关关系。通径分析表明了各性状对番茄红素作用的方向和大小,各农艺性状分别通过其他农艺性状又对番茄红素含量产生影响,这种影响的方向不确定,所以直接通径系数和遗传相关系数的方向不一定相同。综合相关性分析和通径分析的结果,本试验认为在提高番茄红素含量的选育过程中,选择固形物含量高、节间短、单果重小这样性状的材料利于番茄红素含量的提高。3.番茄红素配合力分析和遗传参数估计番茄红素的一般配合力在-0.608～0.734之间,其中以亲本Q0502、Q0504最高,特殊配合力在-0.302～1.208之间,其中组合SQ0502*Q0504的特殊配合力最高。综合一般配合力、特殊配合力及亲本和杂交组合的番茄红素性状值表现,认为亲本Q0502、Q0504是较理想的亲本材料。番茄红素的广义遗传力为57.35%,狭义遗传力为46.36%,其遗传符合加性—显性模型。所以在育种中采用系谱选择以提高和固定高番茄红素性状是有效的,有性杂交育种可在早期世代进行选择。
万群[6]2007年在《RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响》文中研究说明番茄红素(Lycopene)是植物中的一种天然色素，属于类胡萝卜素中的一种，它是许多类胡萝卜素生物合成的中间体，经过环化可形成其它类胡萝卜素。番茄红素主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚等植物的果实，茶的叶片以及萝卜、胡萝卜等植物的根部，其中以番茄果实中的番茄红素含量最高，其含量可达到3～14mg／100g。在成熟的番茄果实中，番茄红素悬浮遍布于果肉中。番茄红素是类胡萝卜素中活性最强的抗氧化剂，有延迟衰老的作用，可以预防和缓解多种疾病，且对人体没有任何毒副作用，故被认定为营养型保健食品。番茄红素在西方饮食中非常盛行，已被许多国家批准使用于食品、化装品和药品。因此，培育高番茄红素的番茄品种，是近年来国内外番茄品质育种拘热点。番茄红素在植物细胞中的合成是在质体和叶绿体中进行的，其生物合成的过程为：八氢番茄红素(Psy)在脱氢酶作用下依次脱氢生成六氢番茄红素、链孢红素和番茄红素。番茄红素在番茄红素环化酶(Lcy)的作用下转化为其它类胡萝卜素。如果通过RNAi抑制番茄果实中番茄红素β环化酶基因的表达，就可以阻止番茄红素降解，促进其积累，从而创造高番茄红素的转基因番茄新种质。本实验从番茄基因组中分离了Pds启动子片段，通过农杆菌介导的方法将Pds-GUS基因导入番茄中，研究Pds启动子的表达特性；同时根据RNA聚合酶Ⅱ介导的RNA沉默(RdRP)原理，将番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)片段通过一段内含子构建成dsRNA基因，并用具有果实特异性表达的Pds启动子调控该RNAi基因的表达，导入番茄后研究抑制Lcy基因表达对番茄果实中番茄红素含量的影响。该研究结果可为借助分子改良途径提高番茄果实的番茄红素含量奠定基础。主要研究结果包括以下几个方面：1．番茄Pds启动子的克隆与功能分析根据GenBank中公布的番茄Pds启动子序列(U46919)设计特异引物，从番茄基因组中分离了长1790bp的Pds启动子序列，测序结果表明所分离的Pds启动子序列和GenBank中公布的一致。通过SalⅠ和BamHⅠ酶切将全长Pds启动子插入到pVCT-2020表达载体中，替换掉该载体中GUS基因的35S启动子，构建成携有Pds-GUS基因表达盒的植物基因表达载体。通过农杆菌介导的转基因方法将Pds-GUS基因转入番茄中，获得的转基因番茄的果实、叶片及根经X-Gluc染色5h，70％乙醇脱色后，显微镜下观察照相。结果表明Pds启动子具有果实特异性的特点。2．番茄红素环化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根据GenBank中公布的番茄红素β环化酶基因(Lcy-β)序列(X86452)设计特异引物，上游引物P166：CTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGCTCGATGCAACTGGCTTCTCTA，通过PCR从番茄基因组中获得了长302bp的Lcy片段，测序结果表明与GenBank公布的一致。3．果实特异性RNAi的植物表达载体的构建通过SalⅠ酶切，补平，再用BamHⅠ酶切后连接，得到Lcy片段反向重复连接的中间克隆载体pMD-srLcy。将pMD-srLcy经BamHⅠ酶切，去磷酸化后与内含子连接，构建RNAi片段的中间克隆载体pMD-RNAi。pMD-RNAi经SalⅠ和Ecl136Ⅱ切下RNAi片段插入到pVCT2020载体中，构建成pVCT-RNAi表达载体。pMD-Pds经SalⅠ和EcoRⅠ切下Pds启动子后，将Pds片段插入到SalⅠ和EcoRⅠ酶切的pVCT-RNAi载体中，构建成pVCT-PdsRNki载体。构建成的pVCT-PdsRNAi表达载体经酶切鉴定，能获得正确的目的带，表明构建的载体正确。4．番茄遗传转化再生体系的建立番茄种子经肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水冲洗掉乙醇；然后在超净台上用10％的次氯酸钠消毒30min，灭菌水漂洗4次后，接种于1／2MS培养基上，暗培养2～3天，待番茄种子发芽后，于25℃，光照强度18001x，16h光／8h暗的光周期条件下培养直到子叶完全展开。切取番茄的子叶和下胚轴，分别接种到MS+1.0mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂的固体培养基上，比较子叶和下胚轴的芽分化能力，结果表明子叶的芽分化能力高于下胚轴。将番茄子叶接种到MS附加不同浓度6-BA(1～3 mg／L)与IAA(0.1～0.3 mg／L)及6-BA(1～3 mg／L)与NAA(0.1～0.3 mg／L)组合的培养基上，筛选适宜芽分化的激素浓度及最佳组合。结果表明在MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂的培养基上番茄子叶的芽诱导率最高，并且诱导芽所需要的时间最短，长出的芽最壮，因此本实验最终采月MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+3％蔗糖+6.5％琼脂组合的培养基来诱导番茄子叶发芽。设计不同浓度的IAA(0.2～0.5mg／L)，观察不定芽生根的速度、数量及生根的质量，以确定适于番茄生根的最佳IAA浓度，结果显示幼苗在不同培养基中都能生根，其中以含0.4 mg／LIAA的培养基生根最快，一周后即出现大量不定根，根系比较壮。为了测定外植体对Kan的敏感性，在筛选的最佳诱导培养基中，加入不同浓度的kan(0、10、20、30、40、50、60、70 mg／L)测定外植体的分化情况，每个浓度3次重复，每次重复20个外植体，接种观察不同浓度kan对番茄子叶分化抑制的效果。结果表明当在浓度为60 mg／L的培养基上，有少量愈伤组织形成，以后逐渐白化、死去，不能分化出芽；含40 mg／Lkan的培养基上多数外植体形成较多的愈伤组织，大部分可分化出绿芽，并且生长正常；因此本实验所用番茄材料适宜的筛选压为kan 50mg／L。5．转基因番茄的获得采用农杆菌介导法，将携带pVCT-PdsRNAi表达载体的新鲜的农杆菌菌液用液体MS培养基重悬后，浸染已经在分化培养基上预培养两天的番茄子叶，将经农杆菌浸染的外植体接种到芽诱导培养基(MS+1.0mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+30g／L蔗糖+琼脂6.5g／L)上28℃暗培养2d，然后将外植体转入抑菌培养基(MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+30 g／L蔗糖+300mg／L羧卞青霉素Cb，pH 5.8)上培养7天，然后把抑菌培养7d后的外植体转移到选择培养基(MS+1.0mg／L 6-BA+0.2mg／L IAA+30g／L蔗糖+琼脂6.5g／L+50 mg／L kan+250 mg／L Cb，pH 5.8)上进行选择培养，培养条件为：温度26±2℃，光照时间16h／d，光照强度3，0001x。选择培养2周后，外植体的切口处逐渐分化出抗性不定芽，将这些抗性芽转入(MS+1.0 mg／L 6-BA+0.2 mg／L IAA+糖30 g／L+琼脂6.5g／L+50 mg几kan+200 mg／L Cb. pH 5.8)新鲜选择培养基中继续进行选择培养，每两周换一次培养基，其间不断的降低Cb的浓度。待抗性苗长到3～4am以上时，从基部切下形成的不定芽，转入MS+0.4 mg／L IAA+30 g／L蔗糖+50 mg／L的Kan的培养基上生根，7～10d后开始长出不定根，等幼苗长到3～4片叶后，将生根后的植株开瓶炼苗3～5d，移栽到人工气候室中让其自然生长直到结果。6．转基因植株的检测通过抗性筛选，本实验共获得了7株转化再生植株，分别提取这7株植株的DNA进行PCR检测，反应体系同扩增Lcy片段一样，反应条件只由72℃延伸1min变为72℃延伸2min外，其他条件不变。其中5株扩增出了预期的条带，表明外源基因已经整合到了番茄基因组中，将鉴定为正确的转基因植株移栽到人工气候室中，让其自然生长直到结果，获得转基因番茄果实。在农杆菌浸染过程中，农杆菌太浓，在后来的培养中外植体容易褐化、坏死；农杆菌太稀获得的抗性植株的机会就减少，因此，应适当掌握农杆菌的浸染浓度，本实验结果认为农杆菌菌液浓度的OD值在0.3～0.6之间是最适合浸染番茄外植体的浓度，同时用液体MS培养基重悬农杆菌是很必要的，可以降低农杆菌对外植体的毒害，增加外植体的成活率。7．转基因番茄中番茄红素含量的测定收获转色期20天后的完全红熟的番茄果实每株两个，研磨成糊以后，每株称取10g番茄糊，加入适量的氯仿在35℃避光提取4小时，离心，转移下层液体至一新的50mL的离心管中，然后向番茄残渣中再加入适量氯仿重复抽提2次，最后用氯仿定容到50mL。将提取的番茄红素溶液迅速用U-1800型紫外分光光度计在502nm的波长下测定番茄红素含量，氯仿做参比，每个材料重复3次，测得一系列吸光度值，取平均值计算番茄红素含量。测定结果表明所获得的5株转基因番茄果实的番茄红素含量都比非转基因番茄果实中番茄红素高，转基因番茄中番茄红素的平均含量是对照的2.1倍，其中1号转基因番茄果实中番茄红素含量增加最多，是对照的2.6倍。
李文枫[7]2014年在《番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证》文中指出番茄(Lycopersicon esculentem.Mill)营养丰富,风味香郁,适应性广,产量高,在世界各地被广泛种植,并成为人们日常的主要蔬菜作物之一。在番茄突变体的果实中含有丰富的番茄红素,而番茄红素具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力和抗癌等功能,因而其食用价值和经济价值倍受关注,已成为国际功能性食物营养指标研究的热点之一,但我国在该方向的研究还处初级阶段。为了增加番茄采收时间、在市场上的上架时间,减少运输过程中的损伤率,近年耐贮型番茄已成为育种的主要目标,但耐贮型番茄普遍存在果实番茄红素含量较低的品质缺陷、并难以有效对其进行选择。随着分子生物学及基因组学的迅猛发展,运用重组DNA技术即基因工程改良作物品质已成为作物分子育种的主要高效途径。近年来,研究者发现了许多影响植物光代谢的单基因突变体,其中番茄高色素hp基因突变体能够提高类胡萝卜素含量,尤其对番茄红素含量的提高最为显着,为此,引起了众多育种者和研究者的高度重视。目前,已发现的hp类突变体中hp1,hp2和hp3对番茄红素含量的影响作用显着。而对于耐贮型番茄果实的番茄红素含量均普遍偏低的问题,已成为现今和未来商业及市场品质需求的一重大缺陷,快速、高效选育高番茄红素的耐贮型番茄品种已成为目前番茄品质育种中急于解决的主要问题之一,而关于耐贮型番茄相关的遗传转化报道也甚少,所以给耐贮型番茄的高效分子品质育种带来了诸多不便。为此,本研究以从美国番茄遗传研究所引进含有3种不同hp基因(hp1, hp2和hp3)类型的7个突变体和加工番茄为对照,通过番茄红素和品质的差异分析及相关分析,筛选其中1个对番茄红素起主导作用同时兼顾其他主要优良品质的hp基因类型为耐贮型番茄转hp基因的研究供体；建立和优化耐贮型番茄的再生体系和遗传转化体系；克隆该hp2基因全长并构建带有attR重组位点的pCAMBIA-1301入门载体；通过农杆菌介导方法将hp2基因导入耐贮型番茄中,获得转基因植株,并对其进行分子和生理指标检测分析,为hp基因在耐贮型番茄中的应用研究提供理论依据,为含高番茄红素的番茄创造新的种质资源。具体研究结果如下：(1)以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素含量的差异分析表明,含不同的hp基因类型番茄果实中番茄红素含量存在显着和极显着差异,含量趋势表现为hp2>hp1>hp3>无hp类型,其中hp2基因对番茄中番茄红素含量具有重要的主导作用,并且果实其他主要综合品质优良。(2)以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素与主要品质含量的相关分析表明,含不同hp基因番茄果实中番茄红素含量与其它5个主要果实品质指标相关性不显着,但均具有正向相关趋势,其相关大小分别为糖酸比>维生素C含量>可溶性蛋白含量>可溶性总糖含量>酸度含量。(3)以含hp2基因突变类型的LA3006和LA4013番茄为材料,通过RT-PCR方法对其进行基因克隆及载体构建分析表明,在番茄LA3006和LA4013中均可以成功获得含有attB序列的hp2全长基因,并构造了带有ccdB基因的重组位点的入门载体,命名为pCAMBIA一1301-ccdB和含hp2基因的植物双元表达载体,命名为pCAMBIA一1301-hp2。(4)以耐贮型番茄品种08076和09836为材料,通过子叶高频再生的方法,对其再生体系中的主要影响因子进行差异分析表明,在耐贮型番茄子叶高频再生体系中,不同番茄品种间仅在出芽数存在极显着差异,其他诱导和再分化影响因子指标差异不显着；其中耐贮型番茄子叶最优高频再生体系为：无菌苗的培养采用,种子用10%NaClO浸种15mmin消毒, MS培养基(进口,2.215g/L)+0.70%琼脂+2%蔗糖；无菌苗培养基采用1/2MS+0.7%琼脂+1%蔗糖；诱导愈伤养培养基为MS+6-BAlmg/L+IAA0.2mg/L；不定芽分化养培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.75mg/L；生根培养基为MS+IAA2.0mg/L,其获得的耐贮型番茄再生频率表现为09836和08076的子叶分化率分别为100%、98.25%。(5)以耐贮型番茄品种09836为材料,利用农杆菌介导方法,对其进行遗传转化分析表明,hp2基因可以较好导入耐贮型番茄09836,其中在共培养时期,成活169份,成活率为42%；在不定芽分化时期,成活65个不定芽,成活率为38%；在生根苗时期,成活38份,成活率为58%；在抗性植株培养时期,最终获得到抗性植株14株,成活率为36%。(6)以遗传转化获得抗性植株为材料,经“目的PCR"."NPTII基因”和“半定量RT-PCR"检测验证分析表明,确定8株表现阳性,分别为T0-01、T0-02、T0-05、T0-06、T0-08、T0-10、T0-12、 T0-14,转化株的阳性率为57.14%。(7)以获得的阳性植株为材料,经方差和多重比较分析表明,果实中番茄红素含量、叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量均极显着获得提高,其中果实中番茄红素含量分别提高了309.64%-1571.08%；阳性番茄植株叶片中叶绿素a提高了139.45%-295.11%,叶片中叶绿素b提高了152.58%-376.29%,叶片中类胡萝卜素含量提高了20.32%-95.72%。(8)以获得的阳性植株为材料,阳性植株的果实番茄红素含量与叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量进行相关分析表明,T。代阳性株果实中番茄红素含量与其叶片中叶绿素a含量和类胡萝卜素含量呈正向显着相关,而与其叶片中叶绿素b含量呈正向极显着相关(r=0.79)；阳性株叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量间存在极显着正相关。(9)通过转基因技术获得了3个转hp2基因的T2代耐贮型番茄09836株,其中T2-1、T2-5和T2-10的果实番茄红素含量分别为33.9.83.7.94.6mg/kg,较非转基因番茄对照提高了3.8-10.6倍；其果实的AS1分别为2.1、1.9和2.3,较对照下降了45.24%-54.76%；其果实货架期分别为48、42和53天,相比对照下降了27.4%-42.47%；其果实硬度分别为3.35kg/cm-2、3.02kg/cm-2和4.05kg/cm-2,相比对照下降了27.68%-46.07%。
王巧丽[8]2014年在《番茄红素-β-环化酶基因干扰载体的构建及其对不同果色番茄注射转化的研究》文中认为番茄类胡萝卜素代谢及产物对番茄和人类都有重要意义。番茄红素-β-环化酶是类胡萝卜素代谢途径中将番茄红素环化形成各种胡萝卜素及相关色素的关键酶。已有研究表明，在果色为粉色和红色的番茄品种中干扰该酶基因的表达可以提高转基因后代的番茄红素含量，然而在其它颜色果实中尚未有类似研究。且以前研究所用的干扰载体多为35S为启动子的组成型表达载体，而番茄以果实作为食用器官。鉴于此，本试验构建了番茄红素-β-环化酶组成型和果实特异型干扰载体，利用这些载体对成熟果色分别为黄色、粉色、紫色、绿色和红色的番茄材料S1、S2、S3、S5和S77进行遗传转化研究，获得了不同果色的LYC-B RNAi转基因番茄，为明确番茄红素-β-环化酶基因对不同果色类胡萝卜素代谢的影响提供依据和基础。主要结果如下：番茄LYC-B基因片段与番茄果实特异型启动子E8的克隆。根据番茄LYC-B基因X86452.1序列克隆了从61bp到861bp的LYC-B1片段和从480bp到781bp的LYC-B2片段，LYC-B1反向和LYC-B2正向连接产物在转录时能形成双链RNA。根据樱桃番茄果实特异型的E8序列（X13437.1）克隆了E8启动子。构建了番茄中间表达载体E8-pBI121，通过载体转化农杆菌GV3101，注射番茄果实诱导基因瞬时表达试验，表明E8-pBI121在S2、S3、S5和S77果实中均表达，验证了E8启动子在果实的启动活性。番茄红素-β-环化酶组成型干扰载体pBI121-B1B2和果实特异型干扰表达载体E8-pBI121-B1B2的构建。在验证E8果实特异型表达的基础上，分别构建了以35S和E8为启动子的植物表达载体，通过载体转化农杆菌GV3101并注射S77叶片和果实诱导基因瞬时表达试验，证明pBI121-B1B2和E8-pBI121-B1B2在番茄果皮、果肉和种子中均有表达，两个载体表达的区别在pBI121-B1B2在叶片中表达，而E8-pBI121-B1B2在叶片中不表达，验证了E8-pBI121-B1B2的果实特异型。农杆菌介导的番茄遗传转化体系的优化。以S5为材料，对不同菌液浓度和侵染时间的研究表明，不同处理外植体存活率在11.54%到81.82%之间变化，OD600为0.760时外植体存活率高于0.971，下胚轴侵染20min存活率最高，子叶侵染15min存活率最高。以S1和S2为材料对共培养时间的研究表明，共培养为36h外植体存活率比48h高，以下胚轴为外植体的存活率比以子叶为外植体的存活率高。果实注射转化体系的建立。注射时期对果实注射转化的影响。S1、S2、S3、S5和S77绿熟期、转色期和坚熟期果实经农杆菌注射后收果率的统计分析结果为，S3和S5收果率在不同注射时期间变化不大，分别为54%和36%左右；S1、S2和S77变化较大，前两个绿熟期最高，第叁个坚熟期最高，分别为65%、75%和60%。不同注射时期间每果收获的种子数的统计分析结果为，S1绿熟期每果收获的种子数最多，其余几个材料均在坚熟期最多，分别为38粒、34粒、50粒、43粒、和25粒。注射量对果实注射转化的影响。S1、S2、S3、S5和S77绿熟期果实经0.2ml、0.4ml、0.6ml和0.8m梯度菌液量农杆菌菌液（OD600=0.5±0.05）注射后收果率和每果收种数统计分析结果为，S1收果率和每果收种数在不同注射量间波动很大，最大收果率对应注射量是0.6ml，最大每果收种数对应的注射量是0.4ml；S2收果率和每果收种数大体随着注射量的增大而降低，最大值对应注射量均为0.2ml；S3收果率随着注射量没有变化，每果收种数最大值对应注射量为0.6ml；S5收果率和每果收种数大体随着注射量的增大而增大，最大值对应注射量为0.8ml。果实注射转化法获得种子的卡那霉素筛选。对注射果实收获的种子在含有100mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中发芽率和第45天幼苗存活率的统计分析结果，在前13天内，所有材料的发芽率呈逐渐增加趋势，第13天发芽率达到最大，之后开始下降，第45天幼苗存活率较第13天下降了44.97%；S1和S5转色期注射的果实收获的种子第45天幼苗存活率最高，分别为74.51%和59.79%；S2和S3坚熟期注射的果实收获的种子第45天幼苗存活率最高，分别为70.30%和24.50%；S2和S3均以0.2ml注射量收获的种子第45天幼苗存活率最高，分别为53.13%%和50.20%。卡那霉素筛选植株的分子鉴定。果实注射得到的种子经卡那霉素筛选后，提取其中170株植株的DNA并进行PCR验证，结果有16株具有目的条带，阳性率约9%。170株植株中有45株来自坚熟期注射收获的种子，这45株中有12株为阳性植株，阳性率约26.66%。16株阳性植株包括3株S2（粉果）、1株S3（紫果）和13株S77（红果），目前正处于结果期，这些材料为后续研究奠定了材料基础。本试验结果表明用果实注射转化法可以获得转基因材料。
李纪锁, 沈火林, 石正强[9]2006年在《鲜食番茄果实中番茄红素含量的主基因-多基因混合遗传分析》文中研究说明选择2个番茄红素含量显着不同的鲜食番茄品系,通过P1、P2、F1、F2、B1和B2六世代联合分析法,研究分析了番茄红素的遗传规律。结果表明:番茄红素的遗传符合一个主基因和加性-显性-上位性多基因模型,主基因遗传力在B1、B2和F2分别为6.85%、34.78%和58.33%,多基因遗传力在B1、B2和F2分别为58.48%、30.69%和0。
齐乃敏[10]2005年在《番茄主要品质性状的遗传研究》文中提出本研究利用双亲交配设计和p~2完全双列杂交设计,研究了番茄果形指数、平均单果重、可溶性固形物含量、维生素C含量、番茄红素含量、可溶性总糖含量、可滴定有机酸含量和糖酸比等8个主要品质性状的遗传。主要结果如下: 一、通过对6个不同类型亲本配制的15个杂交组合的七家系材料,按世代平均数分析方法进行了8个品质性状的遗传模型分析和基因效应估计。结果发现: 1.在15个杂交组合,每组合8个性状,共120个性状-组合中,共有42个性状-组合符合加性—显性模型或加性—显性—上位性模型。 2.在平均单果重和可溶性总糖这2个性状中,满足模型分析的所有组合都符合加性—显性模型,一致性好;而对维生素C这一性状来讲,所有满足模型分析条件的组合都符合加性—显性—上位性模型,表现统一。其他性状则有的杂交组合符合加性—显性模型,有的组合符合加性—显性—上位性模型,表现并不一致。 二、通过对不同类型的6个亲本双列杂交衍生的30个正反交F_1及其亲本材料的8个品质性状进行了方差分析和Wr/Vr分析。结果发现: 1.亲本品质性状间的差异均达到极显着水平,表明亲本选择有效。各个性状在各基因型间均达到极显着水平,因此可以对各个性状进行进一步的遗传分析。各个性状在正反交间也存在极显着的差异,表明存在细胞质效应。因此,应该将正反交分开来,分别分析其遗传模型。 2.8个品质性状中,果形指数和番茄红素在正交以及反交的两套材料均符合加性—显性模型。其中有2个性状的正交组合基因均以显性为主,效应方向为隐性增效,h~2B均大于50%,h~2N均小于50%,并表现超显性;反交组合则相反。其他几个性状由于不存在显性效应或者存在上位性效应而不符合加性—显性模型。
参考文献：
[1]. 番茄中番茄红素含量影响因素及遗传的初步研究[D]. 李纪锁. 中国农业大学. 2003
[2]. 高番茄红素性状的遗传分析及分子标记[D]. 严玉坤. 东北农业大学. 2009
[3]. 卷枝毛霉生物合成番茄红素的研究[D]. 张映曈. 江南大学. 2016
[4]. 西瓜番茄红素的测定及遗传效应分析[D]. 刘清华. 新疆农业大学. 2009
[5]. 番茄果实中番茄红素的遗传分析及与农艺性状的相关性研究[D]. 曲瑞芳. 西北农林科技大学. 2006
[6]. RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响[D]. 万群. 西南大学. 2007
[7]. 番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证[D]. 李文枫. 东北农业大学. 2014
[8]. 番茄红素-β-环化酶基因干扰载体的构建及其对不同果色番茄注射转化的研究[D]. 王巧丽. 西北农林科技大学. 2014
[9]. 鲜食番茄果实中番茄红素含量的主基因-多基因混合遗传分析[J]. 李纪锁, 沈火林, 石正强. 遗传. 2006
[10]. 番茄主要品质性状的遗传研究[D]. 齐乃敏. 扬州大学. 2005
标签：园艺论文; 番茄红素论文; 类胡萝卜素论文; 农杆菌论文; 固体培养基论文; 番茄论文; 基因合成论文; 性状分离论文; 启动子论文;