IncHI2-IS26-Class 1 Integron介导的鼠伤寒沙门氏菌多重耐药

论文摘要

鼠伤寒沙门氏菌是非伤寒沙门氏菌中一种重要的血清型。随着抗生素在临床和养殖业的滥用,鼠伤寒沙门氏菌的耐药情况日趋严重。获得性耐药是细菌耐药性传播的主要原因,其中可接合型质粒的水平接合转移无疑是最重要的传播形式,质粒上的耐药基因盒可以在插入序列和整合子的协同作用下转移。其中I型整合子是携带IntI1整合酶的一类可以捕获外源耐药基因盒的的遗传元件系统;IS26是一种在沙门氏菌中十分常见的可自主转座的移动元件,常常发现存在于质粒上介导临近耐药片段的转移甚至激活耐药基因的表达,二者的存在可能极大地影响耐药性传播的效率。本研究内容及结果如下:1、使用PCR扩增法对255株鼠伤寒沙门氏菌进行IncHI2、IS26和IntI1酶的筛查,其中共检出62株IncHI2阳性菌株,包括临床源的42株（42/180,23.3%）和食品源的20株（20/63,31.7%）。在62株携带IncHI2质粒的鼠伤寒沙门氏菌中,除了一株分离自腹泻病人的SJTUF13368未检出intI1基因以外,其余61株菌均携带intI1基因和IS26,I型整合子和IS26在IncHI2阳性菌株中的检出率高达98.4%（61/62）。2、使用CLSI推荐的琼脂稀释法测定61株IncHI2、IS26和intI1基因阳性菌株的耐药谱,所有菌株耐受磺胺异恶唑（100.0%）,其次是氨苄西林和复方新诺明,耐药率达到了90.2%;对四环素、萘啶酸、氯霉素、链霉素、卡那霉素、阿莫西林-克拉维酸、庆大霉素、环丙沙星、头孢噻呋、头孢曲松和头孢西丁的耐药率分别达到75.4%、73.8%、63.9%、60.7%、47.5%、44.3%、42.6%、39.3%、8.2%、8.2%和1.64%。所有菌株都对阿米卡星、头孢噻吩和阿奇霉素敏感。其中41株临床源和20株食源性的鼠伤寒沙门氏菌对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、环丙沙星、萘啶酸、四环素、复方新诺明、磺胺异恶唑、氨苄西林和阿莫西林-克拉维酸的耐药率之间无显著性差异（P>0.05）。3、对61株三重可转移元件阳性菌株进行接合转移实验,其中使用液体接合法得到24株接合子,使用膜过滤法得到11株接合子。在35株接合子中,除了一株供体菌为临床分离株的SITUF11216-TC未检出IS26以外,其余接合子均携带IS26（97.1%）;17株（48.6%）接合子检出了IntI1整合酶基因,包括5株食源性沙门氏菌接合子和12株医源性沙门氏菌接合子。4、使用PCR质粒复制类型筛查方法对35株接合子进行质粒不相容群鉴定,其中14株接合子只携带IncHI2类型质粒,SJTUF10405-TC携带IncHI2和IncI1类型质粒,SJTUF13383-TC携带IncHI2和IncA/C类型质粒,其余19株接合子不携带18种质粒复制类型中的任何一种。35株接合子对13种抗生素的耐药表型测定表明,磺胺异恶唑、头孢曲松、头孢噻呋抗性的转移率最高,达到了100.0%,其次是萘啶酸（96.7%）、阿莫西林-克拉维酸（75%）、氨苄西林（48.9%）、复方新诺明（46.7%）、氯霉素（43.5%）、卡那霉素（40%）、庆大霉素（40%）、环丙沙星（36.4%）、链霉素（22.7%）和四环素（19.2%）。5、使用S1-PFGE对接合子质粒大小进行研究后发现,15株接合子有单一的质粒条带,其中14株接合子质粒大小在200.0 kb左右,只有一株SJTUF 11216-TC质粒大小约70.0 kb,推测为IncI1质粒。6、对15株接合子的供体菌进行二代测序后,基因组序列上传至MLST数据库确定ST型。同时提取蛋白质序列使用CARD数据库（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）对这15株鼠伤寒沙门氏菌进行耐药序列比对分析,以相似度90%为标准进行筛选,鼠伤寒沙门氏菌全基因组含有氨基糖苷类耐药基因（aac（6’）-Iaa、aac（6’）-Ib3、aac（3）-IV、aph（4）-Ia、aph（6）-Id、aph（3’）-Ia、aadA1、aadA2）、喹诺酮类耐药基因（qacH、oqxA、oqxB）、四环素类耐药基因（tetA、tetR）、利福平耐药基因（arr-3）、氯霉素耐药基因（floR、cmlA6、catB3）、磺胺类耐药基因（sul1、sul2、sul3）、甲氧苄啶耐药基因（dfrA12）和β-内酰胺类耐药基因(blaTEM-1、blaOXA-1、blaCTX-M-14)。且15株鼠伤寒沙门氏菌均属于ST34,同时不同耐药基因种类数目在15株菌株间没有显著性差异（P>0.05）。使用BLASTN对二代测序数据进行耐药基因盒预测分析,得到I型整合子的两种排布模式。综上所述,本文分析了鼠伤寒沙门氏菌携带可移动遗传元件的特征,同时探究了鼠伤寒沙门氏菌菌株的耐药基因携带情况和ST型,分析了IncHI2-IS26-I型整合子介导的多重耐药鼠伤寒沙门氏菌可转移特征,对追踪监控鼠伤寒沙门氏菌的耐药传播具有重要意义。

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摘要

ABSTRACT

英文缩略语索引

第一章绪论

1.1 沙门氏菌

1.1.1 沙门氏菌的基本生物学特性

1.1.2 沙门氏菌的危害

1.1.3 鼠伤寒沙门氏菌的污染及耐药现状

1.1.4 沙门氏菌重要耐药基因研究进展

1.2 插入序列研究进展

1.2.1 插入序列的结构及分类

1.2.2 插入序列的功能

1.2.2.1 改变耐药特性

1.2.2.2 改变毒力

1.2.2.3 改变代谢

1.2.3 IS26与细菌耐药

1.3 整合子研究进展

1.3.1 整合子的结构及分类

1.3.2 I型整合子介导的细菌耐药

1.4 研究目的及意义

第二章鼠伤寒沙门氏菌可移动遗传元件筛查及药敏性分析

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.2 设备与仪器

2.3 实验方法

2.3.1 菌株活化

2.3.2 细菌基因组DNA的提取

2.3.3 可移动遗传元件的PCR筛查

2.3.3.1 IncHI2 PCR筛查

2.3.3.2 IS26 PCR筛查

2.3.3.3 I型整合子intI1 PCR筛查

2.3.4 耐药谱检测

2.4 实验结果

2.4.1 IncHI2、IS26和I型整合子的筛查结果

2.4.2 17种抗生素耐受情况

2.5 小结与讨论

第三章鼠伤寒沙门氏菌质粒水平转移分析

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 培养基

3.1.3 主要试剂

3.2 设备与仪器

3.3 实验方法

3.3.1 质粒接合转移——液体接合法

3.3.2 质粒接合转移——膜过滤接合法

3.3.3 接合子基因组DNA提取

3.3.4 接合子可转移元件的PCR筛查

3.3.5 接合子耐药谱检测

3.3.6 接合子质粒不相容群PCR扩增

3.4 实验结果

3.4.1 质粒接合转移

3.4.2 接合子携带可移动元件情况

3.4.3 接合子耐药情况

3.5 小结与讨论

第四章鼠伤寒沙门氏菌耐药质粒及耐药基因分析

4.1 材料

4.1.1 菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 主要试剂

4.2 设备与仪器

4.3 实验方法

4.3.1 接合子菌株活化

4.3.2 接合子S1-PFGE质粒特征分析

4.3.2.1 制备菌悬液

4.3.2.2 制作小胶块（Plug）

4.3.2.3 裂解细菌

4.3.2.4 清洗胶块

4.3.2.5 限制性酶切胶块

4.3.2.6 制备电泳胶块

4.3.2.7 电泳

4.3.2.8 染色和成像

4.3.3 鼠伤寒沙门氏菌全基因组测序

4.3.3.1 菌株培养活化

4.3.3.2 菌体收集冻存

4.3.3.3 样品质检及文库构建

4.3.3.4 全基因组测序

4.3.3.5 基因组装、预测和注释

4.3.3.6 MLST分型

4.3.3.7 耐药基因分析

4.4 实验结果

4.4.1 接合子S1-PFGE质粒特征分析

4.4.2 MLST分型

4.4.3 耐药基因分析

4.5 小结与讨论

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵杭

导师: 施春雷

关键词: 鼠伤寒沙门氏菌,型整合子

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海交通大学

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFC1600100,2016YFD0401102),国家自然科学基金面上项目(31671943)

分类号: TS201.3

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.003276

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