林谦[1]2003年在《超嗜热菌Pyrococcus furiosus的培养及其α-淀粉酶基因的克隆与表达》文中研究表明α-淀粉酶是最重要的一类工业酶，它们在淀粉加工、酿酒、乙醇生产、纺织和其他工业部门上都有广泛的应用。因为淀粉只在100℃或以上才能完全溶于水溶液，大多数应用于工业上的α-淀粉酶都要求能够在极高的温度(可达110℃)下使用。 来源于强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的α-淀粉酶(PFA)具有应用于工业的潜力，因为其最佳反应温度达100℃，最佳pH为5.5～6.0，且其活力或热稳定性的维持不需要添加钙离子。 Pyrococcus furiosus的小量培养采用排尽氧气后的Schott试剂瓶，同时不断通入氮气，温度保持在98℃。大量培养则采用10升的高压釜，在严格的厌氧条件下培养52小时。由8升的培养液得到的典型产量为2.4g(湿重)。 根据GenBank公布的P．furiosus的α-淀粉酶基因amyA序列设计两条引物，以P．furiosus的基因组DNA为模板进行PCR。将PCR产物插入表达载体pSE380和pJL3，得到重组质粒pSE-amyA和pJL-amyA，转化到大肠杆菌DH5α，Top10，BL21(DE3)中。将重组菌株分别在29℃和37℃诱导表达，测得最高活力为1.5U／ml(在29℃诱导下)。SDS-PAGE亦显示PFA表达出了活力。 在国内未见有该酶的研究报道。
司海洋[2]2016年在《重组Pyrococcus yayanosii CH1-ferritin 对缺铁性贫血雌性SD大鼠补铁效果的研究》文中研究指明铁蛋白是生物机体代谢过程中一个重要的铁贮存蛋白,它具有铁贮存和铁释放作用。铁蛋白在大部分生物体内都有发现,具有耐稀酸pH=2.1、耐稀碱pH--12.1和耐较高温度70～75℃不变性等特性,铁蛋白由外部的蛋白壳和内部铁核组成,铁蛋白壳是一个由24个亚基组成的空心球形结构,蛋白壳直径是12 nm,铁核直径是8 nm。缺铁性贫血(iron deficiency anemia,IDA)是指由于动物机体内铁元素的缺乏,导致血红蛋白含量减少引起的贫血性疾病。目的：本试验利用基因工程技术构建高效表达菌株BL21-CH1-ferritin,并在BL21-CH1-ferritin中高效表达重组CH1-ferritin,对重组CH1-ferritin的物理化学性质进行初步的探究；最后,利用自然矿化的重组CH1-ferritin对患有IDA的大鼠模型进行补铁试验,对其补铁效果进初步的验证,为今后的科研及临床研究提供参考依据。方法：在GenBank中找到Pyrococcus yayanosii CH1基因组序列,在该基因组中找到编码铁蛋白基因序列,通过对CH1-ferritin的密码子偏好性进行修饰,采用基因合成的方法直接合成目的片段。最后,构建高效表达菌株BL21-CH1-ferritin,表达分离纯化重组CH1-ferritin;利用自然矿化方法,使重组CH1-ferritin的蛋白壳内形成矿化铁核；构建缺铁性贫血雌性SD大鼠模型；采用灌胃方法,对动物模型进行补铁试验,验证重组CH1-ferritin补铁效果。结果：成功构建高效表达菌株BL21-CH1-ferritin,纯化得到重组CH1-ferritin,初步探究了其对不同温度和不同pH的耐受性。最后,通过自然矿化反应,获得了具有铁核的重组CH1-ferritin。通过补铁试验,证明自然矿化CH1-ferritin具有良好的补铁效果,空壳重组CH1-ferritin不具备补铁效果。结论：在不改变氨基酸序列的情况下,通过碱基合成的基因序列也能够表达出具有生物活性的铁蛋白；自然矿化CH1-ferritin具有良好的补铁效果。
刘勇[3]2004年在《Pyrococcus horikoshii OT_3基因文库的构建和新酶的筛选》文中研究指明农药的大量使用给人类的生存环境带来了巨大的污染问题。生物治理技术以其突出的优点成为治理环境污染的首选，而筛选得到能够分解含磷、硫或氮化合物等农药的微生物和酶系是生物治理技术中面临的重要课题之一。近年来在极端环境中发现的极端环境微生物（主要是古细菌）因其独特的新陈代谢途径，可以在极端环境下（高温、高压、高离子强度、极端pH等）下稳定生存，因而成为环保应用中的重要酶源，其中，嗜热酶以其突出的特点已经受到广泛的关注。超嗜热菌是最适生长温度为80-110oC的一类极端微生物，从天然及人工高热环境中都能够分离得到超嗜热菌。从超嗜热菌中分离得到的超嗜热酶，具有很高的热稳定性。近年来科学工作者陆续发现了许多超嗜热菌，已经获得其中很多菌株的全基因组序列，但由于嗜热微生物的基因序列同我们已知的微生物同源性存在着显着差异，接近半数的功能基因的序列还未确认。充分利用超嗜热古细菌的基因资源、发现和鉴定其未知基因的功能，对确定超嗜热酶的分子机制、酶学特性和对生命起源与生命进化的探索都有重要的理论意义。在此基础上，开发超嗜热微生物中对农药有降解作用的超嗜热酶，通过有效的进化手段进行高效表达，在生物治污领域也具有广泛的应用价值。本文以嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3为出发菌株，首先建立了该菌株的完整基因文库。提取Pyrococcus horikoshii OT3总DNA，利用限制性内切酶Sau3A I进行不完全酶切，琼脂糖凝胶回收长度为2-6kb大小的片断连接入质粒载体pET15b中，转化大肠<WP=69>杆菌E.coli BL21 (DE3) CodonPlus， 随机挑选单克隆7144个保存于 -80oC76个96孔板中。经检测，文库覆盖率达到99.99%。我们也尝试将质量合乎要求的DNA文库混合后，分装成小份于-80oC冻存；筛选时取小份培养于平板上，利用硝酸纤维素膜影印、裂解筛选。筛选的针对范围为Pyrococcus horikoshii OT3全基因组中未能确认的基因序列；筛选的目的酶是具有农药成分的降解功能的新酶，如水解酶类和氧化酶类，首选的目的酶为酯酶；筛选依据为同为超高温嗜热菌的Aeroperum pernixK1基因组中已经确认了含有酯酶基因，并经纯化表达证实具有良好的活性。我们以超高温嗜热菌的Aeroperum pernix K1的酯酶基因为阳性对照，以选取的E.coli表达系统，利用生色底物筛选技术针对目的酶确立高通量的活性筛选方法。对于保存于96孔板中的基因文库，我们将文库的单克隆复制于96孔板中，经过初培养、诱导表达、菌体的收集和反复冻融破碎、热失活等一系列措施得到每个单克隆的细胞内含物悬液，以对硝基苯酚辛酸酯为底物建立筛选的反应体系，反应温度设为75oC。通过酶标仪快速扫描OD405的吸光度值，以阳性对照或者阴性对照进行筛选。以阳性对照为筛选物的试验表明，我们确实获得了准确度高、速度较快、重复性强的针对酯酶的筛选方法。对于克隆混合保存的文库，我们尝试了利用硝酸纤维素膜进行影印、原位裂解、热失活等措施得到吸附有单克隆表达蛋白的硝酸纤维素膜，以Naphthol AS Nonanoate（(-萘酚壬酸酯）为底物，Fast Blue BB Salt 为显色剂，80℃短暂保温后进行色斑的筛选。以阳性对照为筛选物的试验表明，我们获得的针对酯酶的筛选方<WP=70>法简洁快速、污染少、对设备要求不高，筛选周期很短的优点，但也具有缺乏数据支持、可控性稍差等需要改进的不足。两种筛选方法可以混合使用，更能扬长避短、增加效率。
方淑君[4]2012年在《Exiguobacterium sp.DAU5 α-淀粉酶基因的克隆、表达及酶学性质研究》文中认为a-淀粉酶(EC3.2.1.1a-amylase)能作用于淀粉分子的a-1,4糖苷键,随机地将淀粉从内部切成小分子的糊精和还原糖。α-淀粉酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于水质改良、食品(饲料)工业、粮食加工、酿造、发酵以及医药等行业。本研究采用碘-碘化钾染色法鉴定淀粉酶产生菌,从实验室保存的海虾虾壳分离的菌种中筛选到一株高产α-淀粉酶的菌株DAU5。16S rDNA序列同源性分析和系统进化树结果表明,菌株DAU5属于微小杆菌属(Exiguobacterium),但不属于该属已知的任何种,故命名该菌株为Exiguobacterium sp. DAU5。为克隆Exiguobacterium sp. DAU5的a-淀粉酶基因,通过鸟枪法构建了Exiguobacterium sp. DAU5基因组DNA文库。从该文库筛选得到一株具有α-淀粉酶活性的克隆,对其插入的DNA片段序列分析得知AmyH基因的部分序列。根据此序列和GenBank收录的Exiguobacterium sp.AT1b全基因组序列中一段相似度极高的序列设计引物,PCR扩增得到了Exiguobacterium sp. DAU5AmyH基因。该基因开放阅读框全长1545bp,编码514个氨基酸,所表达的α-淀粉酶属于糖苷水解酶家族13,N末端含有一个长28aa的信号肽。以pET-32a(+)质粒作为载体,成功构建了AmyH基因的表达载体pET-AmyH-sp,并以E.coli BL21(trxB)为寄主菌对该基因诱导表达。表达的AmyH以包涵体形式出现,通过8M尿素变性,组氨酸标签亲和纯化,透析复性后成功得到了具有活性的AmyH纯化蛋白,其活性为每mg蛋白19.7x103U。SDS-PAGE显示AmyH融合蛋白大小约77kDa,使用肠激酶切除标签后的大小为57kDa,和氨基酸序列预测的大小一致。通过酶学性质研究得知：AmyH在30-40℃之间具有较好的活性,其中最适温度为40℃,40℃以下比较稳定,保持1h其酶活力基本不改变。AmyH在pH8.0时表现出较好的稳定性,其最适pH为8.5(甘氨酸-NaOH缓冲液)。Zn2+,Cu2+,Fe2+,SDS和EDTA对AmyH活性有极强抑制作用,5mM的浓度即可使AmyH完全失去活性；Li+, K+, Mg2+和Mn2+对AmyH有一定的抑制作用,而Ca2+,Ni2+和尿素对AmyH的活性无影响；AmyH对醇类和丙酮有较好的耐受性,其中20%浓度的甲醇,乙醇和丙酮时,仍保留93%以上的活性。AmyH对淀粉的亲和力和最大酶活都较高,其Km=0.94mg/mL, Vmax=208×103U/mg。以Kcat/Km值作为催化效率的参考,AmyH要高于已报道的来源于Nostoc sp. PCC711、Candida Antarctia、和、Pyrococcus furiosus的a-淀粉酶。TLC检测AmyH降解各种寡聚麦芽糖和可溶性淀粉的水解产物显示,AmyH能作用的最小寡聚糖为麦芽七糖,水解淀粉的第一个明显的寡聚麦芽糖产物是麦芽叁糖,最终产物为多种低聚麦芽寡糖,这说明AmyH是一个典型的淀粉内切酶。
张顺成, 张朝晖, 陈振明, 周晓云[5]2012年在《超嗜热菌中短链脱氢酶的酶学性质及应用》文中认为短链脱氢酶是一类依赖NAD(P)H的氧化还原酶,具有相似的序列模型和催化机制,在一系列氧化还原反应机制中发挥重要作用。来自超嗜热菌中的短链脱氢酶表现出高稳定性,具有广泛的应用价值。本文概括了超嗜热菌短链脱氢酶的来源,pH、温度、金属离子影响和有机溶剂耐受性等酶学性质,概述了嗜热醇脱氢酶在工业特别是制药业中的作用。
詹冬玲[6]2011年在《超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3半胱氨酸蛋白酶的研究》文中提出来源于超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3半胱氨酸蛋白酶具有超长的稳定性,对其进行研究不仅可以了解生命现象及分子进化规律,而且也为蛋白酶家族的分子改造提供了新途径。该领域的研究不仅丰富了蛋白质工程理论,还为嗜热酶的工业化奠定了基础。本论文将来源于超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3的半胱氨酸蛋白酶基因(PhpⅠ)在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。PhpⅠ以寡聚体形式存在,其基本单元是由166个残基组成的α/β水解酶结构域组成的单体,叁聚体以上有活力。寡聚酶活性中心位于相邻亚基的交界面上,即(A) Cys100-(A) His101-(C) Glu474形成催化叁联体。本实验对其十二聚体进行研究发现,该重组酶最适反应温度为85℃,最适合pH为8.0,具有氨肽酶和内切酶活力,最适底物为R-AMC,该酶的热稳定性、反应动力学和酶活性影响因素等性质均己被表征。我们的研究结果表明：PhpⅠ为第一个DJ-1/Thij/PfpⅠ超家族的嗜热别构蛋白酶。晶体结构解析表明,位于亚基交界面的Arg113和Asn129位点间结合阴离子,即Argl13上的胍基和硫酸根离子的形成两个盐桥,通过水和Asn129形成氢键。我们在WT和突变体Y120P的基础上,分别对Arg113、Asn129进行定点突变,突变体动力学结果显示,阴离子结合位点Arg113、Asn129参与别构调控,Tyr120位点也参与别构调控。此外,本文应用Error Prone-PCR构建随机突变库,分别获得了蛋白酶活力提高约为2-19倍的突变体。结果表明：突变体E12T比活力较野生型提高约3.8倍,K43C提高5.8倍,Y120P比活力较野生型提高约19倍。结合晶体结构、序列比对和生物信息学等方法进行分析：Tyr120位点在DJ-1/Thij/PfpⅠ家族中高度保守,不仅通过氢键与亲核残基Cys100结合,还利用侧链的苯环以P-π作用稳定了催化三联体的另一成员His101,从而扩大了催化叁联体,参与催化反应；底物对接结构显示：Tyr120位点恰好位于底物结合腔的入口处,增加了底物进出通道的空间位阻。所以,Tyr120不仅会影响酶的催化,还会影响底物的结合。综上所述,Tyr120位点是影响别构调控、催化调控和底物结合的关键枢纽。本论文通过结合计算生物学方法和分子生物学定点突变实验技术,探讨嗜热蛋白酶的别构调控机制；揭示不同活性位点残基等对酶的别构调控及催化的影响,丰富和发展别构酶的理论,为嗜热蛋白酶的改造提供一条新的思路。
王跃军, 高强, 孙谧, 郝建华, 王海英[7]2008年在《超嗜热羧酸酯酶的性质和应用研究》文中研究表明来源于超嗜热菌的超嗜热羧酸酯酶,结构上与激素敏感性脂肪酶(HSL)家族近似,属于α/β-水解酶,但是其空间结构比HSL更加紧密而有韧性,具有很强的热稳定性。性质研究表明,温度和有机溶剂对超嗜热羧酸酯酶的活性和对映选择性影响显着;其最适底物一般是对硝基苯酯,部分酯酶的基因含有GGGX基序,能够水解叔醇酯结构。由于超嗜热羧酸酯酶的独特结构和性质,其应用潜力巨大,尤其在拆分手性的外消旋酯方面独具优势。
叶长春[8]2009年在《石油微生物基因工程菌的构建》文中研究表明石油是目前世界经济发展的命脉,石油资源的开发和利用却面临着一系列严峻的问题。微生物采油就是解决这一问题的方案之一。现在,获取采油微生物的主要方法是从自然界筛选和直接利用油层微生物,而天然的石油微生物存在着耐热、耐酸、耐盐性不高的问题。为了解决这一问题,本研究运用基因工程技术,在大肠杆菌中构建了mb7多顺反子操纵子;然后以转座的方式成功地将mb7多顺反子操纵子整合入石油微生物基因组。以原始菌株hub5PN为对照,转座为阳性的石油微生物耐酸、耐高温。实验表明,mb7多顺反子操纵子的导入,可以明显提高石油微生物的耐酸性,也可以提高石油微生物对高温环境的耐受性。论文初步研究了石油微生物基因工程菌的构建方法,剖析了热休克蛋白对石油微生物抗逆性的影响。为了进一步构建具有高度耐酸性,高度耐碱性,高度耐盐的石油微生物,本研究用Sau3A酶对石油微生物的染色体进行不完全酶切,将其插入到无启动子的氯霉素抗性基因之前,构建基因文库。其方法是用氯霉素抗性平板,筛选启动子插入为阳性的石油微生物,并对氯霉素抗性为阳性菌种进行进一步鉴定。采用本方法成功地从石油微生物hub5PN中分离出启动子,hub5PN启动子提高了大肠杆菌对氯霉素的抗性。石油微生物启动子序列的成功分离,为进一步构建高效的石油微生物基因工程菌打下了切实可行的基础。
张代辉[9]2005年在《嗜热古细菌Pyrococcus horikoshii中蛋白酶的克隆、表达及酶学性质研究》文中认为Pyrococcus horikoshii 是从日本海分离的一种超嗜热古细菌,其最适生长温度为100 ℃左右,与生命的原初形态密切相关。而其所具有的蛋白酶类参与许多生物蛋白和肽类分解反应,是生物体代谢过程中必不可少的一类酶。本论文对来自于嗜热古细菌蛋白酶进行分子克隆,在大肠杆菌中表达了嗜热蛋白酶,并对其性质进行了基本研究。我们根据遗传信息,通过生物信息学方法进行分析,确定研究古细菌Pyrococcus horikoshii 中的蛋白酶基因。从培养Pyrococcushorikoshii 古细菌出发,通过提取基因组DNA,设计PCR 引物,再经过PCR 反应,钓出PH 1704 基因,再将其插入表达质粒pET 21a,获得工程菌,大量培养后,通过超声,热变性获得了嗜热蛋白酶。经SDS-聚丙烯酰胺电泳,确定其蛋白单体分子量为18 kDa,聚体形式为二聚体、叁聚体、六聚体等,通过同源GeneDoc 同源序列分析软件分析表明该酶和其他嗜热菌蛋白水解酶同源性较高,属于蛋白水解酶,结构为AlphaBeta 3-Layer(aba) Sandwich。超嗜热蛋白酶PH 1704 的酶学性质研究表明,以Azogelatin 为底物时,该酶发挥催化活力最适温度为90 ℃,最适pH 为8.0,对表面活性剂SDS 表现部分抗性,在1 小时内,1-4%浓度的SDS 可部分提高嗜热蛋白酶的酶活;经1%SDS 处理4 小时后,酶活力依然保持80%左右。该酶还具有较强的热稳定性,重组酶溶液(2 mg/ml)在80 ℃的半衰期为10 小时,95 ℃半衰期为5 小时左右。
乐易林, 倪黎, 郭星星, 邵蔚蓝[10]2016年在《嗜热菌乙醇代谢途径研究进展》文中研究表明微生物利用木质纤维素发酵生产乙醇是可再生能源发展策略之一。人们对常温菌发酵生产乙醇的代谢途径和机理进行了广泛深入的研究。目前天然高效发酵产乙醇菌不能利用五碳糖,因为能利用五碳糖的常温菌乙醇产率低。随着产乙醇嗜热微生物的深入研究,嗜热菌发酵产乙醇的发展为研究带来了契机。文中综述了发酵产乙醇嗜热菌的种类、代谢途径及其关键酶功能特性的研究进展。
参考文献：
[1]. 超嗜热菌Pyrococcus furiosus的培养及其α-淀粉酶基因的克隆与表达[D]. 林谦. 广西大学. 2003
[2]. 重组Pyrococcus yayanosii CH1-ferritin 对缺铁性贫血雌性SD大鼠补铁效果的研究[D]. 司海洋. 沈阳农业大学. 2016
[3]. Pyrococcus horikoshii OT_3基因文库的构建和新酶的筛选[D]. 刘勇. 吉林大学. 2004
[4]. Exiguobacterium sp.DAU5 α-淀粉酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D]. 方淑君. 海南大学. 2012
[5]. 超嗜热菌中短链脱氢酶的酶学性质及应用[J]. 张顺成, 张朝晖, 陈振明, 周晓云. 科技通报. 2012
[6]. 超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3半胱氨酸蛋白酶的研究[D]. 詹冬玲. 吉林大学. 2011
[7]. 超嗜热羧酸酯酶的性质和应用研究[J]. 王跃军, 高强, 孙谧, 郝建华, 王海英. 中国生物工程杂志. 2008
[8]. 石油微生物基因工程菌的构建[D]. 叶长春. 湖北工业大学. 2009
[9]. 嗜热古细菌Pyrococcus horikoshii中蛋白酶的克隆、表达及酶学性质研究[D]. 张代辉. 吉林大学. 2005
[10]. 嗜热菌乙醇代谢途径研究进展[J]. 乐易林, 倪黎, 郭星星, 邵蔚蓝. 江苏农业科学. 2016