穿心莲的中药资源鉴定及其萜类生物合成相关的WRKY TF家族基因的克隆与表达

论文摘要

穿心莲（学名:Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees）,又名春莲秋柳、一见喜;被子植物门,爵床科,穿心莲属,一年生草本植物,具有广泛的地理分布。越来越多的研究表明它可以抑制动脉粥样硬化,治疗高血压、糖尿病和肿瘤,并已用于治疗发烧、感冒、炎症和其他传染病,穿心莲内酯是其代表性萜类产物。穿心莲中成药在药房出售之前都要经过传统的加工程序,如蒸煮和破碎;因此很难对其进行正确鉴定。而本研究中开发的mini-barcode是一个很好的解决方案。转录因子是植物特有调节基因,研究表明WRKY转录因子家族广泛参与到萜类次生代谢途径中,本研究基于穿心莲转录组数据并结合生物信息学,挖掘出穿心莲萜类代谢途径中重要WRKY转录因子基因,并对其进行表达分析。本研究取得如下结果:1.mini-barcode在穿心莲中成药鉴定方面的应用在本研究中,收集了17个穿心莲样品和29个加工样品。基于ITS2序列,设计了110bp长度的分子标记,引物为XH1F/R。该序列在穿心莲中是高度保守和特异的。然后,我们使用新引物从加工样品中扩增穿心莲DNA特征区域,发现其检测范围要大于ITS2F/3R,可得出结论,这个110bp的分子标记可以对穿心莲中成药进行更有效的鉴定,拓宽了DNA条形码在中成药鉴定方面的应用。2.穿心莲萜类代谢途径中关键WRKY转录因子基因的发掘、分析本研究通过茉莉酸甲酯诱导穿心莲小苗,通过转录组测序及生信分析找出跟随穿心莲内酯上调的WRKY转录因子家族基因,克隆出四个目标基因:APWRKY9、APWRKY19、APWRKY36、APWRKY58。对所克隆的目标基因在穿心莲各组织器官中的表达量进行qRT-PCR分析,确认WRKY基因的表达模型为组织差异表达。筛选出两个基因（WRKY19,WRKY36）进行转基因烟草实验,获得了3个转基因烟草植株（包含CK）,后对转基因烟草进行分子检测,qRTPCR检测结果显示转基因烟草材料中目的基因（APWRKY19、APWRKY36）,与对照组相比相对表达量显著上调;其次对烟草萜类合成路径上的基因（NtCPS2与NtABS）进行qRT-PCR检测,结果发现APWRKY19转基因烟草中的NtCPS2基因有显著上调（P<0.05）;其余均没有明显的变化。推测APWRKY19可能在植物萜类的合成途径中起到正调控作用。通过该结果以期进一步揭示WRKY转录因子与萜类合成途径在次生代谢调控层面上的分子机制,为萜类有效成分的合成机制的阐明提供理论基础。

论文目录

摘要

abstract

1 绪论

1.1 穿心莲概述

1.2 穿心莲的中药资源鉴定

1.3 WRKY转录因子家族

1.3.1 结构

1.3.2 功能

1.3.2.1 生物胁迫

1.3.2.2 非生物胁迫

1.3.2.3 植物衰老

1.4 穿心莲萜类生物合成代谢途径

1.5 研究目的、内容及意义

1.5.1 研究目的

1.5.2 研究内容

1.5.3 研究意义

2 Mini-barcode对穿心莲中成药的鉴定

2.1 材料

2.1.1 材料的收集

2.1.2 试剂

2.1.3 仪器

2.2 方法

2.2.1 材料DNA的提取

2.2.2 PCR扩增及测序

2.2.3 序列分析

2.3 结果

2.3.1 ITS2序列扩增和分析

2.3.2 常规DNA条形码对样品进行鉴定的结果

2.3.3 Mini-DNA barcode对样品进行鉴定的结果

2.4 讨论与小结

3 萜类合成代谢相关WRKY基因的筛选与克隆

3.1 材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 试剂及仪器

3.1.3 主要网站及软件

3.1.4 培养基及溶液的配制

3.1.5 引物

3.2 方法

3.2.1 穿心莲内酯合成代谢相关WRKY基因的筛选

3.2.2 穿心莲内酯合成代谢相关WRKY基因的克隆

3.3 结果

3.3.1 穿心莲内酯合成代谢相关WRKY基因的筛选

3.3.2 qRT-PCR的验证结果

3.3.3 穿心莲内酯合成代谢相关WRKY基因的克隆

3.3.4 候选WRKY基因在穿心莲各组织中的转录水平

3.4 讨论与小结穿心莲

3.4.1 讨论

3.4.2 小结

4 萜类合成代谢相关WRKY基因转化烟草

4.1 材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 试剂,仪器及软件

4.1.3 常用培养基及溶液的配制

4.2 方法

4.2.1 Gateway克隆系统的载体构建

4.2.1.1 特异引物设计

4.2.1.2 BP反应及阳性克隆筛选

4.2.1.3 LR反应及阳性克隆筛选

4.2.2 转基因烟草转化体系构建

4.2.3 重组质粒转化烟草

4.3 结果

4.3.1 Gateway克隆系统的载体构建结果

4.3.2 重组质粒载体转化菌株结果

4.3.3 转基因烟草

4.4 讨论与小结

4.4.1 讨论

4.4.2 小结

5 转基因材料的分子检测

5.1 材料

5.1.1 植物材料及试剂

5.1.2 仪器、软件及网站

5.2 方法

5.2.1 qPCR技术检测转基因材料中目标基因的相对表达量

5.2.2 转基因材料中萜类合成基因的表达量

5.3 结果

5.3.1 目标基因在转基因烟草中的相对表达量

5.3.2 转基因材料中萜类合成基因的表达量结果

5.4 讨论与小结

5.4.1 讨论

5.4.2 小结

6 本研究后续发展方向

参考文献

附录

攻读硕士学位期间出版或发表的论著、论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄辰昊

导师: 薛建平

关键词: 穿心莲,次生代谢,转录因子

来源: 淮北师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 淮北师范大学

分类号: Q943.2;S567.219

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穿心莲的中药资源鉴定及其萜类生物合成相关的WRKY TF家族基因的克隆与表达

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