两种DNA损伤修复相关FEN和FEN样核酸酶功能研究

论文摘要

DNA损伤修复是生命体重要的自我保护机制。当基因组产生严重损伤时,细胞可以通过DNA损伤修复系统帮助DNA恢复原来的结构。核酸酶是一类重要的修复相关蛋白,能够降解损伤DNA片段,或者参与同源重组修复中DNA损伤末端的修饰。在修复过程中,蛋白质的翻译后修饰能够调控蛋白质功能,是一类重要的表观遗传。FEN1（Flap endonuclease I,分枝性内切酶）蛋白是参与DNA修复过程中的一类结构特异性核酸内切酶,主要参与DNA复制中冈崎片段的成熟和长片段碱基切除修复（Long-patch base excision repair,LP-BER）途径中降解分枝结构的作用。在研究DNA损伤修复的模式生物耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans,DR）中,DNA聚合酶I（DNA polymerase I,Pol I或PolA）的N端结构域序列与FEN1十分相似,也参与了DNA损伤修复。本文就人源和DR这两种同源蛋白的核酸酶功能进行了研究。为了研究蛋白质翻译后修饰对FEN1蛋白核酸酶功能的影响,我们利用定量蛋白质组学等技术,研究了宫颈癌细胞（HeLa）在UV辐照前后蛋白质磷酸化（Phosphorylation）、乙酰化（Acetylation）和琥珀酰化（Succinylation）修饰水平的变化情况。通过生物化学、分子生物学和细胞生物学等手段验证了DNA损伤修复关键酶FEN1的保守乙酰化位点对该蛋白功能及细胞基因组稳定性的影响。我们还验证了DR菌中DNA Pol I蛋白的N端结构域的FEN-like核酸酶功能以及其对于DNA损伤修复的影响。具体结果如下:1、新鉴定到1551个磷酸化修饰位点,其中DNA损伤修复相关蛋白的磷酸化修饰水平变化明显。乙酰化修饰蛋白和琥珀酰化修饰蛋白存在较高重叠性,尤其是三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA循环）重要蛋白酶的乙酰和琥珀酰化修饰水平在UV辐照后出现明显上调或下调。2、验证了K252/254位点是主要的FEN1乙酰化修饰位点,FEN1突变蛋白结合DNA底物的效率降低从而导致FEN1核酸酶活性下降,且突变细胞株在UV辐照下的细胞凋亡率明显增加。3、生化试验证明DR菌DNA聚合酶A（drPolA）的N端截短蛋白也具有核酸外切酶活性和FEN活性。N端保守的金属离子结合位点天冬氨酸119/120突变成丙氨酸后导致蛋白的核酸外切酶活性降低。drPolA全长蛋白在镁离子(Mg2+)或者锰离子(Mn2+)存在下都能行使核酸外切酶活性,但在聚合功能环境下并不表现聚合酶活性,而119/120金属离子结合位点突变蛋白和N端缺失的截短蛋白drPolA-C能在体外观察到聚合酶活性。另外我们得到N端缺失突变株DR,在UV和γ辐照下发现突变株敏感度大大增加,说明N端可能参与到重要DNA损伤修复通路中。

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致谢

摘要

Abstract

主要缩略词

1 文献综述

1.1 DNA损伤修复的概述

1.1.1 DNA损伤修复系统概述

1.1.2 耐辐射奇球菌概述

1.2 DNA损伤修复相关核酸酶概述

1.2.1 DNA损伤修复相关核酸酶的研究进展

1.2.2 FEN1 蛋白的概述

1.2.3 FEN/FEN样蛋白概述

1.2.4 DNA聚合酶Ⅰ与 DNA损伤修复

1.3 蛋白质翻译后修饰

1.3.1 蛋白质的乙酰化和琥珀酰化

1.3.2 蛋白质翻译后修饰对蛋白质功能的调控

1.3.3 DNA损伤修复相关蛋白的翻译后修饰

2 HeLa细胞UV辐照前后磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰蛋白分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验设备和耗材

2.2.2 实验材料与方法

2.2.3 数据分析

2.2.4 细胞培养

2.2.5 细胞免疫共沉淀

2.2.6 Western-blotting

2.2.7 细胞周期阻滞

2.3 结果与分析

2.3.1 HeLa细胞磷酸化、乙酰化和琥珀酰化数据数量分析

2.3.2 磷酸化位点氨基酸二级结构分析

2.3.3 磷酸化、乙酰化和琥珀酰化肽段motif分析

2.3.4 磷酸化、乙酰化和琥珀酰化的功能聚类分析和亚细胞定位

2.3.5 DNA损伤修复相关蛋白磷酸化修饰水平的变化

2.3.6 UV胁迫下HeLa细胞乙酰化琥珀酰化蛋白互作分析

2.3.7 UV辐照影响TCA循环中蛋白质的乙酰化琥珀酰化水平

2.3.8 磷酸化蛋白质验证

2.3.9 乙酰化修饰对FEN1 蛋白功能的影响

2.4 小结

3 耐辐射奇球菌DNA聚合酶Ⅰ的 N端核酸酶体内功能研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验设备与细菌培养

3.2.2 实验菌株及各种突变株、补偿株的构建

3.2.3 drPolA生物信息学分析

3.2.4 drPolA突变株的表型试验

3.2.5 生存率的测定

3.2.6 生长曲线测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 drPolA的全长序列比对和N端5’核酸酶序列分析

3.3.2 drPolA-N端二级结构分析和金属离子在结合位点预测

3.3.3 drPolA N端敲除株与补偿株的构建与验证

3.3.4 drPolA敲除株生存曲线

3.3.5 drPolA N端截短突变体在胁迫条件下的生存情况

3.4 小结

4 耐辐射奇球菌DNA聚合酶Ⅰ蛋白体外核酸酶功能分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 drPolA全长及截短蛋白的表达和纯化

4.2.2 PolA蛋白各个截短蛋白及其点突变全长蛋白核酸酶活性实验

4.2.3 聚合酶活性和核酸酶活性生化实验

4.3 结果与讨论

4.3.1 耐辐射奇球菌PolA全长及截短蛋白的纯化

4.3.2 drPolA蛋白的金属偏好性研究

4.3.3 drpolA的 N端结构域具有核酸外切酶活性

4.3.4 drPolA N端金属离子结合位点突变蛋白酶活性

4.3.5 drPolA的 N端核酸酶与聚合酶功能的联系

4.4 小结

5 总结与展望

附录

参考文献

博士期间发表论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈宣亦

导师: 华跃进

关键词: 损伤修复,核酸酶,磷酸化,乙酰化,琥珀酰化

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江大学

基金: 国家自然科学基金(项目编号:31870051,31210103904),国家重点研发计划(项目编号:2017YFA0503900),国家基础研究计划(项目编号:2015CB910600),浙江省自然科学基金(项目编号: LY16C050003),浙江省科学技术厅(KN20160607)

分类号: Q75

DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001963

总页数: 124

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