淮安市疾病预防控制中心淮安223001
摘要：目的：建立辣椒面中酸性橙Ⅱ的HPLC测定方法。方法：选择HPLC法测定辣椒面中酸性橙Ⅱ的理想色谱条件，并测定辣椒面中酸性橙Ⅱ的含量及加标回收率，作方法学论证。结果：酸性橙Ⅱ在0.1~20µg/ml的范围内，线性良好，线性方程y=34.94x－2.697，r=0.9998。酸性橙Ⅱ最低检出浓度为0.1mg/L。样品添加浓度为0.5～10mg/kg时，方法回收率为87.5%～93.7%。结论：以HPLC法检测非法添加于辣椒面中酸性橙Ⅱ的含量，操作简便、定量准确可靠。
关键词：酸性橙Ⅱ；辣椒面；HPLC
Abstract：Objective：ToestablishanHPLCmethodforquantitationofacidorangeⅡinchilipowder.Methods：SelectingthebestchromatographconditionstodeterminetheconcentrationofacidorangeⅡinchilipowderandtheaddedstandardrecoveriesofit.ThendotheHPLCmethodologydemonstrationusingtheselectedchromatographconditions.Results：ThisHPLCmethodexhibitedalinearrelationwithin0140～100100μg/mlacidorangeⅡcontent.Theregressionequationwasy=34.94x－2.697（r=0.9998）andtheminimumdetectablelimitofthismethodwas0.1mg/L.Furthermore，therecoveriesofbasicorangewere51.6%～57.5%whilethecontentsofaddedstandardwere0.5～10mg/kg.Conclusion：Thisisasimple，accurateandreliableHPLCmethodfordeterminationofacidorangeⅡinchiliowder.
Keywords：AcidorangeⅡ；Chilipowder；HPLC
色素酸性橙Ⅱ又名金橙Ⅱ，二号橙，桔黄橙，酸性金黄Ⅱ或酸性艳橙GR，俗名金黄粉，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠。酸性橙Ⅱ是一种工业染料，主要用于蚕丝、羊毛织品和皮革的染色，禁止作为食品添加剂使用。但由于酸性橙Ⅱ具有色泽鲜艳，着色稳定和价廉的特点，一些不法食品生产者在食品中违规添加酸性橙Ⅱ，极大危害消费者的身体健康。卫生部重新汇总发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中“产品类别”增加“鲍汁、腌卤肉制品、红壳瓜子、辣椒面和豆瓣酱”。但因酸性橙为化工原料，目前对食品中酸性橙Ⅱ的检测在国家标准及地方标准中仍是空白。
文献报道酸性橙Ⅱ的测定方法有纸层析法、分光光度法、反相高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等[1-4]。本文旨在通过研究和优化酸性橙Ⅱ在辣椒面中的定量和定性检测方法，建立快速、准确、实用的高效液相色谱检测方法，为辣椒面的市场质量监督以及安全检测提供理论依据。
1材料与方法
1.1仪器
高效液相色谱仪：Agilent1260，配二极管阵列检测器及数据处理器；超声波清洗器；食品粉粹机；漩涡混匀器；氮吹仪；固相萃取装置。
1.2试剂
酸性橙Ⅱ；甲醇（色谱纯）；乙醇、氨水等均为分析纯；聚酰胺固相萃取柱：1000mg/6ml。
1.3色谱条件
色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，5µm）或性能相当者；流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵溶液；流速：1mL/min，梯度洗脱见表1；柱温：30℃；检测波长：484nm；进样体积：10µL。
1.4分析方法
1.4.1标准曲线绘制：精密称取0.100g酸性橙Ⅱ，于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的酸性橙Ⅱ标准贮备液。精密吸取标准贮备液，用流动相稀释配制成浓度为0.1µg/mL、0.2µg/mL、0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、5.0µg/mL、10.0µg/mL、20.0µg/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱测定。
1.4.2样品处理：准确称取2g辣椒面于15mL具塞离心管中，加入10mL乙醇震荡提取5min，5000r/min离心5min，取上清液于另一离心管中，残渣中加乙醇10mL，重复提取一次，合并两次上清液，备用。聚酰胺固相萃取柱依次用3mL水、3mL乙醇活化，备用液过柱，控制流速小于2mL/min。用水3mL和乙醇3mL淋洗，乙醇-氨水-水溶液4mL洗脱，收集洗脱液，于80℃氮气吹干，用流动相1.0mL溶解残余物，涡旋1min，10000r/min离心5min，取上清液，供高效液相色谱测定。
1.4.3测定方法取试样溶液和相应的对照溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。对照溶液及试样溶液中酸性橙Ⅱ响应值应在仪器检测的线性范围之内。
2结果与讨论
2.1波长选择
取5.0μg/mL的酸性橙Ⅱ标准使用液在1.3的色谱条件下进样，在200~600nm范围内对酸性橙Ⅱ进行全扫描（图1），选定484nm作为检测波长。
2.4线性关系及检测限
酸性橙Ⅱ标准工作液系列，按方法的实验条件进样，以所得峰面积A对浓度C（μg/mL）进行回归分析，结果表明在0.1-20μg/mL的标准溶液浓度范围内，酸性橙Ⅱ浓度与响应值有良好的线性关系（图5），其回归方程为：y=34.94x－2.697；相关系数：r=0.9998。根据色谱响应值S/N≥3标准计算，酸性橙Ⅱ最低检出浓度为0.08mg/L。
3小结
综上所述，本方法操作简便，精密度高，回收率好，在0.1～20μg/mL的浓度范围内线性关系良好，为酸性橙Ⅱ标准方法制定提供理论支持及市场上染色辣椒面的卫生监督提供较好的判定依据。
参考文献：
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[2]雷波，分光光度法对混合染料浓度的同时测定[J].染整技术，2003，3：35-37.
[3]张秀尧，蔡欣欣.反相高效液相色谱法快速测定良品中违规使用的酸性橙Ⅱ染料[J].中国卫生检验杂志，2004，14（2）：204．
[4]刘华良，荣维广，王联红，等．液相色谱串联质谱法检测鲍鱼汁中的酸性橙Ⅱ[J]，中国食品卫生杂志，2010，22（1）：16—18．
作者简介：杭学宇（1972-），男，本科，副主任技师，主要从事理化检验工作。