张伟[1]2004年在《肝脏卵圆细胞在原发性肝癌发生过程中作用的实验研究》文中研究说明一、研究背景 肝脏干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。近年来，随着对肝脏干细胞在肝脏损伤和修复中作用的研究进一步深入，以OVC为代表的肝脏干细胞越来越成为人们关注的焦点。在胚胎发育过程中肝脏干细胞以肝细胞的形式存在，在成年哺乳动物的肝组织中以OVC存在，其特点是细胞小，呈卵圆型，核大而胞浆少。本课题组研究发OVC与原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)关系密切。在此基础上，我们采用光学显微镜、电子显微镜和免疫组化方法观察OVC在肝癌发生过程中的迁移和超微结构变化；以3’-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3’-methyl dimethylamino azobenzene,DAB)为诱导剂，建立大鼠肝脏OVC增殖模型，密度梯度离心法分离OVC，应用表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)对培养的OVC进行干预，观察OVC的细胞生物学变化；初步从组织、细胞、蛋白叁个水平研究OVC在肝癌发生过程的作用和体外调控方法。 二、目的 本实验旨在探讨OVC在大鼠原发性肝细胞癌发生过程中的迁移及其超微结构的变化规律、摸索OVC的分离培养方法以及EGF对体外培养的OVC生长调控的机理。 叁、方法和结果 1．采用DAB饲喂大鼠，诱导建立肝癌动物模型，结果显示DAB是一种简单经济有效的肝癌诱导剂。 2．全程病检监控肝组织的病理变化，发现HCC发生发展的过程可分为早、中、晚期叁个阶段，分别是炎性变期、增生硬化期、癌变期；采用光镜、电子显微镜以及免疫组化的方法，分别在肝癌发生的早、中、晚期观察OVC在大鼠肝癌发生过程中的迁移变化和细胞超微结构的改变。结果显示：在诱癌早期，OVC首先出现于汇管区；在诱癌中期，OVC穿过界板浸润至肝小叶内；诱癌晚期，OVC散在分布于癌结节内，在癌灶周围有OVC堆积。电子显微镜观察显示在诱癌过程中，OVC逐渐出现细胞核增大且不规则、染色质边聚、细胞与周围组织间隙增宽等改变。免疫组化结果显示在诱癌的早期，CK18阳性的卵圆细胞首先出现于汇管区，呈点状分布;CK19阳性的卵圆细胞在汇管区片状分布;在诱癌中期，汇管区CK18阳性着色的卵圆细胞增多;在诱癌晚期，癌结节开始形成，CK18阳性细胞表达进一步增多，集中在汇管区，癌结节内也可见散在的阳性细胞;CK19阳性细胞仍呈大量表达，散在分布于癌结节内。 3.采用IV型胶原酶分次静脉灌注和改良密度梯度离心法分离肝脏卵圆细胞，结果显示该方法能成功获得高密度的细胞，所分离的细胞细胞形态学特点，以及同时表达CK18、CK19两种标记物，符合卵圆细胞特点。 4.观察体外培养的OVC在EGF的调控下的细胞生物学特点，同时采用westem blot法检测OVC p21ras蛋白的表达。结果显示:OVC pZ lras蛋白表达与细胞活性呈正相关(r=0.891p<0.01)。四、结论 1.OVC的增殖迁移贯穿大鼠肝癌发生过程。在此过程中OVC逐渐具有部分癌细胞的超微结构特点，提示OVC在诱癌剂的持续作用下参与HCC的形成。 2.Iv型胶原酶分次静脉灌注和改良密度梯度离心法能有效获得肝脏卵圆细胞，方法简便经济。 3.EGF对于oVc的体外培养生长是必须的，能够通过增加P21ras蛋白的表达够促进OVC的生长。
赵宾宾[2]2015年在《地五养肝胶囊抑制2-AAF/PH大鼠肝癌前病变的作用及机制》文中研究说明目的:通过复制2-AAF/PH大鼠肝癌前病变模型,观察体现“补肾生髓成肝”治疗法则的地五养肝胶囊对正常肝脏再生和肝癌前病变的作用及其机制,提出中医药防治肝癌前病变的新策略,丰富“肝主生发”(髓生肝、髓失生肝、补肾生髓成肝)的科学内涵,提高中医药防治肝癌的能力和水平。方法:采用SPF级Wistar大鼠复制2-AAF/PH大鼠肝癌前病变模型,将实验大鼠分为4组(每组16只),正常对照组(10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、假手术对照组(2AAF+假手术+10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、模型组(PHx+2AAF+10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、DWYG组(PHx+2AAF+10 ml/kg/日地五养肝胶囊灌胃),每组从实验开始分别实施上述干预,至到不同时间点处死实验动物。按肝大部切除术后第8、10、14、17、19、22天不同时间点分6批处死实验动物,共384只实验大鼠,统计不同时间点大鼠死亡数,Log-rank法比较大鼠生存曲线。获取肝组织标本和股骨标本,显微镜下观察肝脏病理变化;并采用免疫组化方法观察肝组织内卵圆细胞标志物CD34、AFP、CK19,造血细胞标志物CD45、Thy1.1,肝细胞标志物ALB表达;采用percoll密度梯度分离骨髓细胞中的单个核细胞,运用流式细胞术检测单个核细胞中的CD34+CD45双阳性细胞;运用Bio-Rad公司Bio-plex悬液芯片系统检测再生肝组织内的与肝再生密切相关的细胞因子;运用Western blot法检测AFP、CK19、Thy1.1、ALB、Wnt1、Wnt3、β-catenin、FZD2、GSK3β、C-myc、cyclin D1、EpCAM蛋白表达。结果:DWYG组的生存曲线一直在模型组之上,并获得统计差异,(p<0.05,n=96),提示DWYG组2-AAF/PH大鼠的生存预后优于模型组。不同时间点单位视野内细胞核数目比较结果:术后第8天,模型组(718.00000±131.75740)高于空白组(487.33330±74.44640);术后第10天,模型组(675.44450±123.33200)高于空白组(467.83330±104.62010)和假手术组(416.55550±87.40296);术后第14天,模型组(778.571 40±74.99079)高于空白组(406.50000±73.45941)和假手术组(418.00000±98.00638);术后第17天,模型组(985.83330±459.18690)高于空白组(466.50000±52.62984)和假手术组(483.22220±79.32808);术后第19天,模型组(932.33330±194.63780)高于空白组(450.16670±52.94305)和假手术组(546.88890±145.07880);术后第22天,模型组(1030.8330±150.81830)高于空白组(407.33330±29.40521)和假手术组(645.3333±186.0255);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(790.66670±155.25290)高于空白组(467.83330±104.62010);术后第14天,dwyg组(632.88890±213.65130)高于空白组(406.50000±73.45941);术后第17天,dwyg组(894.58330±166.37060)高于空白组(466.50000±52.62984);术后第22天,dwyg组(794.83330±246.67020)高于空白组(407.33330±29.40521);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核面积总量比较结果:术后第10天,模型组(354634.1±61307.27)高于假手术组(193935.7±66317.37);术后第14天,模型组(545256.9±139460.2)高于空白组(266762.6±81448.47)和假手术组(267810.2±68476.35);术后第17天,模型组(649764.0±352785.3)高于空白组(215684.8±49102.53)和假手术组(237966.6±41024.46);术后第19天,模型组(931558.5±556737.7)高于空白组(233773.8±38409.17)和假手术组(302993.2±142219.0);术后第22天,模型组(577851.2±185634.6)高于空白组(214124.7±37308.11);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(614474.5±152446.6)高于空白组(215684.8±49102.53);术后第19天,dwyg组(403424.6±126890.8)低于模型组(931558.5±556737.7);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核平均直径比较结果:术后第10天,模型组(25.30816±1.31760)高于假手术组(23.06589±1.16258);术后第17天,模型组(25.85540±1.61349)高于假手术组(23.39901±0.62696);术后第19天,模型组(29.70243±4.58321)高于空白组(24.37762±0.60042)和假手术组(24.08170±2.40167);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核iod值比较结果:术后第8天,模型组(151210.50±52440.44)高于假手术组(88003.13±11347.88);术后第17天,模型组(235629.80±119848.80)高于空白组(94303.05±22828.83)和假手术组(90270.37±13371.88);术后第19天,模型组(280996.10±121112.60)高于空白组(98838.04±3774.729)和假手术组(101573.60±46453.50);术后第22天,模型组(214187.60±61403.04)高于空白组(92825.63±21232.69);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(226990.10±47799.56)高于空白组(94303.05±22828.83);术后第19天,dwyg组(133893.80±35922.41)低于模型组(280996.10±121112.60);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点肝癌前病变(肝组织结节数)比较结果:术后第8天,模型组(15.33333±2.08167)高于假手术组(3.66667±2.08167);术后第10天,模型组(12.33333±3.78594)高于假手术组(2.66667±0.57735);术后第14天,模型组(14.33333±5.50757)高于假手术组(1.00000±1.00000);术后第17天,模型组(10.00000±1.00000)高于假手术组(0.66667±0.57735);术后第19天,模型组(4.66667±1.15470)高于假手术组(1.66667±1.52753);术后第22天,模型组(2.33333±0.57735)高于假手术组(0.00000±0.00000);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01。术后第8天,dwyg组(9.33333±2.51661)低于模型组(15.33333±2.08167);术后第22天,dwyg组(0.66667±0.57735)低于模型组(2.33333±0.57735);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01。不同时间点afp的od值比较:术后第17天,模型组(0.00143±0.00279)高于空白组(0.00005±0.00011);术后第19天,模型组(0.00504±0.00494)高于空白组(0.00101±0.00213);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00704±0.00621)高于空白组(0.00181±0.00175),经统计学处理,差异显着,p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00704±0.00621)高于模型组(0.00030±0.00032);术后第17天,dwyg组(0.00001±0.00003)低于模型组(0.00143±0.00279);术后第19天,dwyg组(0.00144±0.00273)低于模型组(0.00503±0.00494);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点cd34的od值比较:术后第19天,模型组(0.00106±0.00149)高于空白组(0.00000±0.00001);术后第22天,模型组(0.00004±0.00004)高于空白组(0.00000±0.00000),以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00004±0.00006);术后第19天,dwyg组(0.00001±0.00002)低于模型组(0.00106±0.00149);术后第22天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00004±0.00004);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点ck19的od值比较:术后第17天,模型组(0.00836±0.00770)高于空白组(0.00015±0.00018);术后第8天,dwyg组(0.00714±0.00457)高于空白组(0.00154±0.00100);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.00714±0.00457)高于模型组(0.00138±0.00215);术后第17天,dwyg组(0.00169±0.00229)低于模型组(0.00836±0.00770);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点cd45的od值比较:术后第8天,模型组(0.02223±0.01637)高于空白组(0.00063±0.00099);术后第10天,模型组(0.01182±0.00432)高于空白组(00.00000±0.00000);术后第22天,模型组(0.00062±0.00056)高于空白组(0.00001±0.00002);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.00182±0.00336)低于模型组(0.02223±0.01637);术后第10天,dwyg组(0.00311±0.00680)低于模型组(0.01182±0.00432);术后第22天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00062±0.00056);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点thy1.1的od值比较:术后第19天,模型组(0.00488±0.00628)高于空白组(0.00028±0.00042),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第19天,dwyg组(0.00116±0.00154)低于模型组(0.00488±0.00628),经统计学处理,差异显着,p<0.01。不同时间点alb的od值比较:术后第14天,模型组(0.00193±0.00228)alb的od值在高于空白组(0.00006±0.00008);术后第17天,模型组(0.01740±0.01170)高于空白组(0.00223±0.00196);术后第19天,模型组(0.00989±0.00447)高于空白组(0.00097±0.00121);术后第22天,模型组(0.00044±0.00019)高于空白组(0.00002±0.00002);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00030±0.00039)低于模型组(0.00193±0.00228);术后第17天,dwyg组(0.00092±0.00106)低于模型组(0.01740±0.01170);术后第19天,dwyg组(0.00602±0.00253)低于模型组(0.00989±0.00447);术后第22天,dwyg组(0.00009±0.00017)低于模型组(0.00044±0.00019);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点afp的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(3.22937±0.67848)高于空白组(0.42980±0.00491);术后第17天,dwyg组(1.74258±0.40137)高于空白组(0.42980±0.00491);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(1.74258±0.40137)低于模型组(3.22937±0.67848),经统计学处理,差异显着,p<0.05。不同时间点ck19的蛋白表达水平比较:术后第22天,模型组(0.97433±0.26563)高于空白组(0.49627±0.03081),经统计学处理,差异显着,p<0.05。术后第10天,dwyg组(0.78806±0.28183)高于模型组(0.22565±0.05949),经统计学处理,差异显着,p<0.01。不同时间点thy1.1的蛋白表达水平比较:术后第8天,模型组(0.99196±0.03836)高于空白组(0.50287±0.01344);术后第17天,模型组(5.54601±0.05300)高于空白组(0.59333±0.02435);术后第22天,模型组(3.75083±0.16050)高于空白组(0.53597±0.05286);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(1.94592±0.22803)高于空白组(0.50287±0.01344);术后第10天,dwyg组(11.82147±5.36504)高于空白组(0.56464±0.06698);术后第17天,dwyg组(2.48814±0.26399)高于空白组(0.59333±0.02435);术后第22天,dwyg组(0.97038±0.10725)高于空白组(0.53597±0.05286);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(1.94592±0.22803)高于模型组(0.99196±0.03836);术后第17天,dwyg组(2.48814±0.26399)低于模型组(5.54601±0.05300);术后第22天,dwyg组(0.97038±0.10725)低于模型组(3.75083±0.16050);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点alb的蛋白表达水平比较:术后第8天,模型组(0.27453±0.01486)低于空白组(1.03074±0.02754);术后第17天,模型组(1.84682±0.18736)高于空白组(1.14338±0.01306);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.68833±0.23554)高于模型组(0.27453±0.01486),经统计学处理,差异显着,p<0.05。不同时间点cd34/cd45双阳性细胞率结果比较:术后第10天,模型组(1.36±0.10)高于假手术组(0.54±0.03)和正常对照组(0.80±0.10),经统计学处理,差异显着,p<0.05。术后第10天,dwyg组(1.51±0.11)高于模型组(1.36±0.10);术后第14天,dwyg组(1.32±0.05)高于模型组(0.64±0.05);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.05。不同时间点wnt-1的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(1.32779±0.35836)高于空白组(0.36270±0.01673),经统计学处理,差异显着,p<0.05。不同时间点wnt-3的蛋白表达水平比较:术后第19天,模型组(1.85876±0.54423)高于空白组(0.11918±0.01016),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.04430±0.00041)低于空白组(0.10873±0.01290),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.04430±0.00041)低于模型组(0.09193±0.01315);术后第19天,dwyg组(0.23867±0.06112)低于模型组(1.85876±0.54423);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点β-catenin的蛋白表达水平比较:术后第14天,模型组(0.60503±0.25672)高于空白组(0.18496±0.00238),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第17天,dwyg组(0.07359±0.02606)低于空白组(0.19992±0.00922),经统计学处理,差异显着,p<0.01。不同时间点fzd2的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(0.76346±0.02471)高于空白组(0.47247±0.02180),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.13873±0.01626)低于空白组(0.43712±0.00564),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.86342±0.30096)高于模型组(0.41012±0.10035);术后第14天,dwyg组(0.13873±0.01626)低于模型组(0.29838±0.09992);术后第17天,dwyg组(0.38007±0.08595)低于模型组(0.76346±0.02471);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点gsk3β的蛋白表达水平比较:术后第14天,模型组(1.08911±0.04313)高于空白组(0.33607±0.00433);术后第22天,模型组(0.72570±0.09099)高于空白组(0.31403±0.03097);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(9.06168±2.25561)高于空白组(0.33082±0.03924),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第10天,dwyg组(9.06168±2.25561)高于模型组(1.36823±0.11584);术后第14天,dwyg组(0.39855±0.04579)低于模型组(1.08911±0.04313);术后第22天,dwyg组(0.20201±0.12896)低于模型组(0.72570±0.09099);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点c-myc的蛋白表达水平比较:术后第10天,模型组(0.38214±0.08574)高于空白组(0.10696±0.01269);术后第14天,模型组(0.41937±0.23529)高于空白组(0.10866±0.00140);术后第19天,模型组(0.25829±0.04226)高于空白组(0.11362±0.00875);术后第22天,模型组(0.05292±0.00212)低于空白组(0.10153±0.01001);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(0.37789±0.07038)高于空白组(0.10696±0.01269),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第19天,dwyg组(0.13076±0.03385)低于模型组(0.25829±0.04226),经统计学处理,差异显着,p<0.01。不同时间点cyclind1的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(1.39008±0.00242)高于空白组(0.06501±0.00300),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第10天,dwyg组(1.66466±0.27007)高于空白组(0.05921±0.00702);术后第14天,dwyg组(2.05675±0.83282)高于空白组(0.06015±0.00078);术后第17天,dwyg组(0.24702±0.05901)高于空白组(0.06501±0.00300);术后第22天,dwyg组(0.02090±0.01496)低于空白组(0.05620±0.00554);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(1.66466±0.27007)高于模型组(0.17641±0.05093);术后第14天,dwyg组(2.05675±0.83282)高于模型组(0.69284±0.29621);术后第17天,dwyg组(0.24702±0.05901)低于模型组(1.39008±0.00242);术后第22天,dwyg组(0.02090±0.01496)低于模型组(0.05703±0.00188);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点epcam的蛋白表达水平比较:术后第19天,模型组(0.82235±0.13035)高于空白组(0.37034±0.02852),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.08119±0.03697)低于空白组(0.35418±0.00457),经统计学处理,差异显着,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.08119±0.03697)低于模型组(0.33000±0.03355),经统计学处理,差异显着,p<0.01。不同时间点il-1检测结果显示:与正常组(981.99±303.24)相比,模型组显着上调细胞因子il-1在术后第10天(3967.33±1966.02)、术后第19天(2230.46±1883.23)的表达,经统计学处理,未获得统计差异。术后第10天,dwyg组(1554.40±554.75)低于模型组(3967.33±1966.02);术后第19天,dwyg组(827.53±254.19)低于模型组(2230.46±1883.23);以上数据经统计学处理,均有显着性差异,p<0.05。不同时间点il-6检测结果显示:与正常组(614.93±287.00)相比,模型组显着下调细胞因子il-6在术后第10天(244.82±128.15)和术后第19天(241.52±5.28)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点gro/kc检测结果显示:与正常组(76.66±25.83)相比,模型组显着上调细胞因子gro/kc在术后第10天(575.22±241.02)、术后第14天(716.44±317.68)、术后第19天(115.15±67.89)的表达,经统计学处理,未获得统计差异。术后第14天,dwyg组(145.89±120.66)低于模型组(716.44±317.68),经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。不同时间点ifn-γ检测结果显示:与正常组(167.83±90.62)相比,模型组显着下调ifn-γ在术后第10天(48.08±12.92)、术后第14天(48.2±16.95)、术后第19天(50.53±11.7)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点tnf-α检测结果显示:与正常组(440.9±114.57)相比,模型组显着下调tnf-α在术后第10天(138.77±35.82)、术后第14天(174.9±55.57)、术后第19天(152.39±41.05)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点VEGF检测结果显示:与正常组(147.74±35.31)相比,模型组显着上调细胞因子VEGF在术后第19天(274.25±200.09)的表达,经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。术后第19天,DWYG组(101.42±7.55)低于模型组(274.2 5±200.09),经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。结论:地五养肝胶囊具有促进正常肝脏再生和抗肝癌前病变的作用。地五养肝胶囊对卵圆细胞的增殖和分化具有双向调节作用:肝再生早期(肝切除术后8-14天),地五养肝胶囊促进肝内卵圆细胞和骨髓干细胞增殖和分化,有利于肝脏再生修复;肝再生晚期(肝切除术后17-22天),地五养肝胶囊抑制卵圆细胞的过度增殖和异常分化,有利于防治肝细胞癌变,抑制“髓失生肝”。其分子机制之一可能是地五养肝胶囊在肝切除术后8天或更早已激活Wnt/β-catenin通路,促进卵圆细胞的增殖以加速肝脏再生;而肝再生晚期(肝切除术后14-22天),地五养肝胶囊发挥抑制卵圆细胞的过度增殖和异常分化,有利于防治肝细胞癌变的作用,其机制可能是在更早的加速肝脏修复之后,地五养肝胶囊抑制了Wnt/β-catenin通路的持续激活,从而抑制卵圆细胞的过度增殖和癌变倾向。地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境影响骨髓干细胞和卵圆细胞的分化方向及其相关信号通路可能是其发挥抗肝癌前病变作用的生物学基础。
梁天成[3]2009年在《肝卵圆细胞与原发性肝癌相关性分析》文中指出目的:探讨肝卵圆细胞与原发肝癌的相关性,为原发性肝癌发生的“癌干细胞”假说提供临床病理学依据。方法:以明确诊断为正常肝组(6例:男性3例,女性3例),肝血管瘤组(7例:男性3例,女性4例),肝内胆管结石组(8例:男性5例,女性3例),肝炎后肝硬化组(6例:男性4例,女性2例),原发性肝癌组(8例:男性7例,女性1例),肝癌合并肝硬化组(9例:男性7例,女性2例)肝组织为检测对象,分别于手术后采取肝组织标本(其中肝癌标本包括癌灶及癌旁组织)体积≥1.0 cm3,运用免疫组化方法检测表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP肝卵圆细胞数。同时按不同的肝病背景、病理学诊断(良恶性肝病、有无合并肝硬化),再次分为不同比较组别,运用SPSS 13.0统计软件分析比较各组内、组间肝卵圆细胞数目有无差异,P<0.05有统计学意义,探讨肝卵圆细胞与原发肝癌之间有无相关性。结果:(1)各检测组间性别、年龄无显着差异(P>0.05),随着肝病严重程度的不同,表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit的卵圆细胞数目有增多趋势;(2)原发性肝癌组、肝癌合并肝硬化组、肝炎后肝硬化组、肝内胆管结石组表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit的卵圆细胞数与肝血管瘤组、正常肝组有显着差异(P<0.05)。AFP仅在原发性肝癌组、肝癌合并肝硬化组中检测到,其表达AFP的阳性率分别为62.5%(5/8)和66.67%(6/9),但AFP在原发性肝癌组、肝癌合并肝硬化组间的差异无统计学意义;(3)按照肝组织是否合并肝硬化以及良恶性肝病分组。当肝脏发生肝硬化时,良性肝病组(肝内胆管结石组、肝炎后肝硬化组)与恶性肝病变组(肝癌合并肝硬化组)比较,表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP阳性细胞数均有显着差异;肝脏无肝硬化时,肝血管瘤组与原发性肝癌组比较,表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP阳性肝卵圆细胞数仍有显着差异。因此,无论是否合并肝硬化,恶性肝病肝组织表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP的肝卵圆细胞与正常肝、良性肝病均有显着差异;(4)恶性肝病组间比较,即肝癌合并肝硬化组与原发性肝癌组比较,表达Ck-8/18、C-kit、AFP阳性细胞数均无显着差异,但是表达Ck-7、Ck-19的肝卵圆细胞数有显着差异;良性肝病组间比较,肝血管瘤组与有肝硬化组(肝内胆管结石组、肝炎后肝硬化组)比较,发现良性肝病中没有表达AFP的细胞,表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit的阳性细胞数有显着差异;(5)正常肝组与肝血管瘤组比较,肝血管瘤组中有少许C-kit表达的阳性细胞;两组均表达Ck-8/18的细胞,其差别无统计学意义,表达Ck-7、Ck-19的阳性细胞数有显着差异;(6)正常肝组与肝内胆管结石组比较,肝内胆管结石组中有表达C-kit的阳性细胞,两组均有表达Ck-8/18的细胞,但无统计学意义,而表达Ck-7、Ck-19、C-kit叁者的阳性细胞数均显着差异;(7)肝血管瘤组与肝内胆管结石组比较,表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19的阳性细胞数无显着差异,表达C-kit的阳性细胞数有显着差异;(8)有肝硬化的各肝病组比较,C-kit在良性肝病中表达无明显差异,在肝癌组中表达明显升高,表达有显着差异。结论:(1)发生了肝癌的肝组织内表达AFP的阳性细胞数与其余各组均有显着差异;Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit的表达在良、恶性肝病组之间有显着差异,提示肝卵圆细胞参与了肿瘤的生长、细胞分化调控;(2)正常的生理状态下肝组织内有少许肝干细胞被激活、增殖。但是当正常肝发展到肝硬化过程中,则有较多的肝卵圆细胞的激活、增殖,并且Ck-7、Ck-19、C-kit的表达的肝卵细胞在由正常肝发展到肝硬化时起重要作用;(3)Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP的表达差异,说明由正常肝,到肝硬化,再到肝癌过程中,肝卵圆细胞发生了不同程度的激活、增殖,并可能导致了原发性肝癌的发生,其中表达C-kit的肝卵圆细胞在有肝硬化到肝癌的过程中起了重要的作用;(4)当良性肝病已经转化为恶性病变后,其表达C-kit的肝卵圆细胞数目差异无统计学意义,为今后进一步研究肝癌的病理生理机制以及干细胞治疗肝癌,提供了新的思路。
元海成[4]2010年在《肝脏卵圆细胞在急性胆道梗阻中变化的研究》文中指出一、背景和目的现已发现人慢性肝病组织如肝硬化、亚大块肝坏死后肝再生、儿童先天性肝外胆道闭锁、遗传性血色病、慢性病毒性肝炎、原发性肝癌中都存在类似于卵圆细胞的肝前体细胞。这种肝前体细胞定位于汇管区、纤维间隔、汇管区旁肝实质、假小叶及炎症边界。研究发现卵圆细胞存在于肝硬化,肝癌等各种慢性肝病的肝脏组织中,肝脏卵圆细胞在慢性肝炎肝脏组织中阳性表达。随着肝脏卵圆细胞特异性标记物的发现,卵圆细胞相关研究成为热点,特别是肝脏卵圆细胞双重分化特性及参加肝脏损伤后的修复的相关研究,更为研究者探究肝脏损伤的保护、治疗及肝纤维化的形成机制提供了最新途径。在肝胆外科临床中,胆道梗阻、胆汁淤积是常见的病理环境,较长时间梗阻,可诱发永久性肝损害,甚至发展成肝纤维化及肝硬化,是临床治疗的难题,相关发病机制基础研究有现实意义。目前肝脏卵圆细胞与外科急性胆道梗阻后肝组织损伤及修复的相关研究,国内外鲜见报道。另外,胆道梗阻模型可以结扎啮齿类动物的胆总管获得,大鼠的胆总管结扎模型已有了评估和描述,为研究提供了可靠的动物模型。本研究通过结扎Wistar大鼠胆总管动物模型,复制急性胆道梗阻病理状态,评估胆总管结扎模型的可行性并总结模型建立经验；通过组织学技术,探究肝脏卵圆细胞与急性胆道梗阻后肝脏病理改变的相关性。二、材料与方法雄性Wistar大鼠90只。体重250-300克,将动物随机分成实验组和对照组。每组每个时间点通过胆总管接扎,造模成功8只。术后观察所有动物的体重、活动及黄疸情况。术后第1、2、3、5、7天,每组各处死8只,取血行总胆红素(TBIL)、直胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)检查。取肝右叶应用4%多聚甲醛固定,行肝脏组织学分析。1、通过观察不同时间点实验动物的体重、黄疸及活动变化情况,采集不同时间点血液标本,进行酶学检测,总结模型死亡率和成功率。2、绘制不同时间点实验动物体重、酶学指标变化曲线,总结其与病情、病程之间的相关性。3、通过肉眼及HE染色观察急性胆道梗阻不同时间点肝脏形态改变。4、通过胶原特殊染色,观察肝脏胶原增生情况。5、通过免疫组化,OV-6标记卵圆细胞,观察不同时间点卵圆细胞的数目、分布,探究其与急性胆道梗阻的关系及变化规律。叁、结果预实验中未分离胆管及结扎胆管位置过高,出现动物死亡和模型成功率仅40%。改进后实验组造模成功率达90%。实验组大鼠术后第1天有体重显着减轻,但此后体重稳定升高,但体重均低于实验对照组。术后2天内活动显着减少,第3天后基本恢复正常,而假手术动物活力无明显变化。实验组动物自第1天出现黄疸,于术后第3天黄疸加重。对照组有一只出现黄疸,从组中剔除。胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)后TBIL和DBIL两组有显着差异(P<0.001)。ALT迅速增加,高峰在术后第1-2天,第3天后迅速下降。ALP术后第2天达到高峰,第3天后稳步增加。急性胆道梗阻后,肝组织学检查显示：梗阻时间延长,肝细胞发生变性坏死程度加重,伴有大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润,从胆管梗阻处逐渐转向肝门。胶原染色特异性显示胶原纤维为红色,显微镜下观察胶原纤维分布与含量两组术后第1及2天无明显差异,而术后第3、5、7天两组的胶原含量及分布范围有明显差异。实验组肝脏胶原纤维梗阻时间延长则增生明显。OV-6免疫组化阳性染色的细胞数目及分布范围随着梗阻时间的延长而增加,实验组和对照组有明显差异。(P<0.05)四、结论1、按照本实验描述的模型建立方法,简单易行、重复性及稳定性好,可以得到满意急性胆道梗阻模型。造模成功率与分离胆管的精确度、结扎位置、力度、胆管侧枝存在及动物个体差异性相关。2、急性胆道梗阻后肝脏细胞损伤逐渐加重,胆道梗阻后第3天,是肝脏细胞急性损伤反应最强烈的时间点,之后机体开始进入自我调节及修复过程。胆道梗阻后7天,激活了具有分化能力的储备细胞,修复过程伴随着肝细胞间的纤维组织增生,出现纤维化,但未发现典型的肝脏假小叶形成。3、本实验发现卵圆细胞参与肝细胞在急性胆道梗阻后损伤的修复过程。肝卵圆细胞不仅是参与肝损伤修复的主导细胞,也是肝组织内对进行性受损反应最敏感的一种细胞。受损的肝脏中卵圆细胞的增生规律与胶原纤维增生具有相似性。
龚加庆[5]2002年在《肝干细胞参与肝癌形成及乌司他丁对肝癌干预作用的实验研究》文中研究说明一、研究背景 干细胞(stem cell)为一类不分化而长期生存且保持多种分化潜能的细胞群；祖细胞(progenitor cell)为一类分化能力、自我更新、自我维持能力受限制，只有单向或双向分化潜能且生存时间相对较短的细胞群。大量研究证实成体肝脏内存在肝干细胞，卵圆细胞作为一种祖细胞可分化为肝细胞和胆管上皮细胞，它在肝损伤时积极参与肝组织的修复，目前肝干细胞成了国内外研究的热点。肝损伤的异常修复就意味着可能癌变，作为肝干细胞代表的卵圆细胞是否也参与了原发性肝细胞癌(HCC)的形成?这一问题目前还不清楚。肝干细胞的起源和定位怎样?这一问题也存在较大的争议。本课题通过建立HCC动物模型，研究①肝干细胞在肝组织内的定位；②肝干细胞与HCC的关系。 二、目的 本实验旨在探讨以卵圆细胞为代表的肝干细胞在HCC发生、发展过程中在肝组织内分布规律，并通过免疫组化、RT-PCR等技术阐明PCNA、c-kit、c-myc在HCC发生、发展过程中的动态演变规律，从细胞、蛋白、基因叁个水平初步研究卵圆细胞向癌细胞异常分化的机制，同时观察乌司他丁对HCC发生、发展的抑制作用，为肝癌的临床预防和治疗探索新的途径。 叁、方法和结果 1．DAB诱导建立大鼠肝癌动物模型，并于诱癌全程予以乌司他丁腹腔注射干预，结果显示DAB是一种简单、经济、实惠、有效的肝癌诱导剂；乌司他丁干预组HCC的发生例数显着低于诱癌组，且干预组癌结节面积亦低于同期诱癌组。 2．全程监测肝组织的病理变化，发现HCC发生、发展的过程可分为炎性变期、增生纤维化期、癌变期叁个阶段；卵圆细胞首先在炎性变早期出现于汇管区胆管上皮层，随着肝损伤的加重，卵圆细胞逐渐增多，并向小叶内迁移；肝癌形成期，癌结节内及其周边均可见到卵圆细胞。 3．应用免疫组化检测肝癌形成过程中。－kit和PCNA的表达，结果 显示：（）C－kit编码蛋白阳性染色首先大量出现于汇管区，卵圆细胞 可见明显阳性着色，随着肝损伤的加重，肝癌形成，阳性染色仍以汇管 区为主，还可散在出现在小叶内和癌结节内。（2）PCNA阳性表达定 位于细胞核，炎性变早期，表达强度首先以汇管区的卵圆细胞为最高； 炎性变中期，小叶内大量肝细胞亦呈阳性表达，此时，细胞的阳性染色 率达高峰；增生纤维化期，阳性率下降，至肝癌形成期又上升。i 4．采用 RTICR法对 c－myc mRNA的表达水平行定量分析，发现 c－myc mRNA的表达量在肝癌发生过程中呈增高趋势，乌司他丁的干预 对其表达量无明显影响。 四、结论 l．肝损伤初期，卵圆细胞出现于汇管区的胆管上皮层，随着肝损伤 的加重和肝纤维增生，卵圆细胞便沿着肝纤维逐渐向肝小叶内迁移生 长。肝癌形成期，癌结节内及其周边亦可见卵圆细胞分布，因此从细胞 水平说，卵圆细胞对肝细胞癌的形成和发展具有重要作用。 2．对PCNA免疫组化研究发现，肝损伤初期卵圆细胞即表达最强的 增殖活性，可见卵圆细胞具有参与肝损伤修复的重要作用；对肝干细胞 的表面标志抗原c－kit免疫组化研究发现，c．kit基因蛋白定位于汇管区 的卵圆细胞，其表达贯穿于从肝损伤到肝癌发生、发展的全过程。因此 从蛋白水平说，肝损伤的异常修复意味着可能癌变，而癌变的全过程始 终有卵圆细胞的参与。 3．c－myc基因为一种恶性组织的维持基因，从肝损伤到肝癌的形 成，其表达量呈逐渐增高趋势。由于c－myc基因蛋白主要表达于卵圆细 胞，可见从基因水平上说，卵圆细胞参与了肝细胞癌的形成和发展。 4．乌司他丁在肝损伤时对炎性细胞的浸润具有强大的抑制作用，对 肝细胞具有较好的保护作用，对HCC的发展具有一定的抑制作用。
孙珅[6]2014年在《胆管梗阻大鼠模型中卵原细胞的超微病理结构和时序性变化的研究》文中认为一、背景和目的在肝胆外科临床中,胆管梗阻、胆汁淤积是常见的病理环境,较长时间梗阻,可诱发永久性肝损害,甚至发展成肝纤维化及肝硬化,是临床治疗的难题,相关发病机制基础研究有现实意义。现已发现人类慢性肝病组织如肝硬化、亚急性肝坏死后肝再生、儿童先天性肝外胆管闭锁、遗传性血色病、慢性病毒性肝炎、原发性肝癌中都存在类似于卵圆细胞的肝前体细胞。这种肝前体细胞定位于汇管区、纤维间隔、汇管区旁肝实质、假小叶及炎症边界。随着肝脏卵圆细胞特异性标记物的发现,卵圆细胞相关研究成为热点,特别是肝脏卵圆细胞参与肝脏损伤修复、肝脏纤维化的相关研究。这些为研究肝脏损伤的保护、治疗及肝纤维化的形成机制提供了最新途径。因此,本研究通过结扎Wistar大鼠胆总管,模拟胆管梗阻病理状态,通过免疫组化、PCR、透射电镜技术,探讨这一病理过程肝脏卵圆细胞在胆管梗阻肝脏纤维化过程中的变化与发挥的作用。二、材料与方法雄性Wistar大鼠60只,体重250-300克,健康,无明显畸形,将动物随机分成两组,一组(30只)作为实验组实施近肝门端胆总管单线结扎(BDL术)；另一组(30只)作为对照组实施假手术,开腹游离胆总管但不结扎。术后相同条件下饲养。分别于术后第1天、2天、3天、7天、14天、21天处死大鼠,每组各处死5只,取肝右叶应用4%多聚甲醛固定,留作免疫组化；取肝左叶-80℃冻存,留作RT-PCR检测；肝中叶小片肝组织,固定后留作电镜观察。1、通过肉眼及HE染色观察胆管梗阻不同时间点肝脏形态改变。2、通过免疫组化,OV-6标记卵圆细胞,观察不同时间点卵圆细胞的数目、分布。3、通过投射电子显微镜观察卵原细胞的超微结构变化。4、通过PCR检测各目的基因：肝细胞生长因子(HGF),胶原蛋白I (COL I),观察不同时间点各基因的表达情况。叁、结果1、大体结果Wistar大鼠胆管梗阻后可见肝脏黄染并肿胀,肝脏淤血、水肿。福尔马林固定后部分大鼠的肝叶标本,可见表面粗糙,颜色灰白等肝组织早期肝纤维化的表现。对照组：肝脏标本各肝叶色泽红润,表面光滑。2、HE染色结果：对照组：肝组织结构正常。实验组：术后第1天见少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；术后第2天少许新增生无管腔的小胆管,少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；术后第3天新增生的细小胆管和无管腔的小胆管,嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润较术后第2天明显增加,肝细胞轻度变性,可见灶状和片状坏死,肝组织汇管区可见胆管增生和纤维组织细胞增生,偶见胆管扩张；术后第7天肝细胞出现变性坏死发生率增加及程度加重,重者见片状出血和坏死,肝组织门区可见胆管增生和纤维细胞增生；术后14天小叶结构受到破坏,可见肝细胞空泡变性及坏死；术后21天小叶结构破坏更加严重,大量肝细胞坏死。随时间进展肝脏损伤、纤维化程度逐渐加重。3、免疫组化结果OV-6免疫组化阳性染色的细胞数目及分布范围随着梗阻时间的延长而增加,实验组和对照组有明显差异。OV-6阳性细胞表达部位主要位于汇管区胆管及肝间质新增生胆管及无管腔的小胆管细胞胞浆中。4、电子显微镜观察结果对照组：肝组织及肝细胞结构基本正常。实验组：术后1天血管旁可见少量卵圆形核细胞,有少量圆钝的胞质突起,核浆比大,胞质量少,细胞器数量少；术后2天肝细胞间也可找到一些卵圆形细胞,细胞切面呈钟形或胖橄榄形,核近似卵圆形,核大,核浆比大,胞质少,发育差；术后3天部分肝血窦内皮损伤,内皮细胞断裂崩解,内皮细胞核小,异染色质呈浓染的团块,边集于核膜下。枯否细胞内吞噬泡数量较多,细胞间隙内卵圆形核细胞多见；术后7天肝细胞板出现大的空隙,或仅残存细胞框架,一些肝细胞呈不可逆损伤,一些细胞呈凋亡样坏死,肝细胞间可见多形核白细胞存在,一些细胞仅可分辨核的大小差异,细胞无可分辨的细胞细节,在形态尚好的部位,仍可找到少量存活的卵圆核细胞,已向肝细胞方向分化；术后14天肝细胞间可见一些立方形细胞,4-5个细胞形成片块,细胞间可见小管样结构,两端的细胞间有紧密连接,小管内有微绒毛伸入,腔内无内容物,核形近似卵圆,但不甚规则,核膜有凹陷,细胞器中等发育,细胞片块与肝细胞有连接；术后21天一些胶原纤维束提示窦周间隙的位置。肝细胞间可见卵圆形核细胞片块,其中有的细胞含大量脂滴；有的细胞是成纤维细胞,细胞周围有大量胶原纤维存在；其余细胞性质不可辨。5、RT-PCR结果在对照组和实验组大鼠肝脏中均能检测出目的基因的表达。统计分析显示两组COLⅠ的表达差异从第1天开始有统计学意义,HGF的表达差异从第3天开始有统计学意义。对实验组不同天数组间的表达研究发现COLⅠ在3-7天无统计学意义,HGF在1-3天、7-21天无统计学意义,而其他相邻各组间均有统计学意义,COLⅠ指标1-3天增长趋势最明显,HGF指标3-7天增长趋势最明显。四、结论1、研究发现肝外胆管结扎造成胆管梗阻的大鼠模型,其肝脏呈现胆汁淤积性、进行性加重的肝脏受损表现。卵圆细胞参与胆管梗阻后损伤的修复过程,其时序性变化趋势与肝脏修复相关细胞因子变化趋势相似,可能参与肝脏受损后的修复过程。2、利用电子显微镜观察到卵原细胞的超微结构形态,描述了其细胞特点及周围结构的形态特点,证实了卵原细胞的存在,直观的观察到其时序性过程中的变化。3、研究发现实验组肝脏纤维化相关基因表达明显高于对照组,并且随着梗阻天数的增加表达量增加,其中COLⅠ可显示纤维化的进程,HGF与肝脏受损后的修复过程有关。4、研究发现在肝纤维化过程中的3-7天是肝脏受损过程的特殊时期,第3天之前以肝脏受损过程为主要表现；第3天开始出现修复损伤表现,纤维化趋势减弱；第7天之后为持续的的肝脏损伤、纤维化进程。
张伟硕[7]2012年在《苦参碱对大鼠肝卵圆细胞凋亡与分化影响的初步研究》文中指出目的在原发性肝细胞癌的形成过程前即癌前病变期,卵圆细胞的大量增殖以及异型分化参与了这一病变的形成,采取相应措施阻断其向肝癌细胞发展,可能对肝癌的预防和治疗具有重要意义。苦参碱为中药苦参的主要药效成分,应用于我国临床治疗肝病及肿瘤已经多年,课题组前期研究显示苦参碱能调节Notch.Wnt-1等信号通路,从而影响肝癌细胞的多种生物学行为,其中包括：抑制增殖,促进凋亡与分化等。研究结果提示了苦参碱潜在的防治原发性肝癌的作用,但是其全面、具体的细胞学及分子生物学机制仍然有待补充和说明,尤其是在卵圆细胞方面。基于部分前期工作基础,本研究采用苦参碱预防干预SD大鼠肝卵圆细胞增生模型和体外苦参碱培养Wb-f344大鼠肝卵圆细胞,初步观察苦参碱对卵圆细胞凋亡、分化、增殖以及自噬的影响,旨在初步说明苦参碱对于肝癌癌前病变(卵圆细胞增生)的可能防治作用及其机制。方法7周龄清洁级雄性SD大鼠50只,体重204.8±11.44g,由北京大学医学部实验动物科学部提供。饲养于中日友好临床医学研究所SPF级动物实验中心,饮用水及饲料为无菌条件,环境温度18-26℃,湿度40-60%。采用随机设计分为3组：A、B组每组20只,C组10只。A组为模型组：B组为苦参碱组；C组为正常对照组。采用苦参碱干预+DEN+Solt-Farber方法建立大鼠卵圆细胞增殖模型。光镜及电镜观察组织中卵圆细胞结构；免疫组织化学法检测大鼠肝脏卵圆细胞的甲胎蛋AFP、细胞角蛋白CK-19和自噬分子LC3表达的变化；TUNEL法检测卵圆细胞凋亡表达。苦参碱体外培养Wb-f344大鼠肝卵圆细胞,建立模型,应用Real time PCR方法检测标记的ALB mRNA表达变化。统计学方法：应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(X±s)表示,正态数据采用方差分析检验,非正态数据采用非参数秩和检验,定量指标非正态分布的用中位数、四分位间距表示,P<0.05为有意义,表示差异具有显着性。结果实验成功构建大鼠DEN+Solt-Farber模型,肝脏病理组织切片能够发现典型卵圆细胞存在,伴有或不伴异常肝细胞或者肝癌细胞,综合评判模型成功率为：A组90%,B组85%,总成率为87.5%。免疫组化检测提示,苦参碱干预能显着减少卵圆细胞增生且能减少炎症细胞侵润,使卵圆细胞AFP及CK-19表达下降(p<0.05),LC3无显着性表达(p>0.05)；TUNEL法检测模型组与苦参碱干预组和正常对照组相比较,汇管区卵圆细胞凋亡显着增多。苦参碱诱导WB-F344细胞标记基因分子ALB mRNA与对照GAPDH相比表达增加(p<0.05)。结论研究结果初步提示：苦参碱能促进大鼠肝卵圆细胞凋亡,同时使细胞向成熟肝细胞分化,但对其自噬作用影响较小
张鹏, 朱晓峰, 焦兴元[8]2015年在《卵圆细胞的生物学特性及其与原发性肝癌的关系》文中认为目的介绍卵圆细胞的概况及其与原发性肝癌关系的研究进展。方法查阅国内外近年来有关卵圆细胞和原发性肝癌关系的文献并做综述。结果卵圆细胞是一种肝脏干细胞,定位于Hering管。在肝细胞严重受损或分裂增生受抑制时可向肝细胞和胆管上皮细胞分化。近年来研究发现了许多新的卵圆细胞表面标志物,推动了卵圆细胞的识别。卵圆细胞的增生程度与慢性肝病的恶性程度和炎症程度呈正相关,并且参与了肝癌的发生、发展、复发和转移,与肝癌的预后密切相关。结论深入研究卵圆细胞的生物学特性,将为原发性肝癌的诊断、治疗和预防提供新的策略。
颜政[9]2006年在《肝细胞癌来源于肝前体细胞—卵圆细胞的实验研究》文中研究指明背景 长期以来，人们一直在寻找肿瘤的细胞起源和病因，试图从肿瘤的发病机制中找到一种行之有效的预防和治疗手段。随着干细胞研究的不断深入，发现干细胞最重要和最有用的特征是它的自我更新能力。通过这一特征能够发现干细胞和癌细胞之间有惊人的相似，推测肿瘤可能通常起源于正常干细胞的转化，相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新，故癌细胞中可能包含有肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSC)----它们是一些极少的具有自我更新不定潜能的驱使肿瘤形成的细胞。目前，在血液肿瘤、乳腺癌、脑肿瘤及前列腺癌中，肿瘤干细胞研究取得了一定的进展。但是，其它实体瘤中肿瘤干细胞的分离与鉴定、肿瘤干细胞特征以及与成体干细胞的确切关系尚未见导报到，迫切需要通过实验进行探索。 原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在所有恶性肿瘤中居第叁位。目前，关于HCC的细胞源研究取得了较大进展，已有实验证明肝内卵圆细胞在致癌因素的作用下可向癌细胞异常分化，因此，有许多学者认为肝内卵圆细胞为HCC的源细胞。这些实验证据又使人们联想到肝癌可能来源肿瘤干细胞。可能在致癌物质的的作用下卵圆细胞异常分化，导致肝细胞癌变。肝脏干细胞与肿瘤干细胞的关系尚没有系统研究的报告。 肿瘤具有异质性，瘤组织并非全部由染色体异常的细胞组成，其内增殖状态的细胞实际上是肿瘤组织的干细胞。大量的动物自体瘤移植试验证明，只有
史冀华[10]2010年在《大鼠肝脏部分切除术后肝脏再生及微小肝癌复发的实验研究及其干预策略》文中认为背景和目的：肝细胞癌简称肝癌,居全世界癌症发病率的第5位,死亡率居第3位,年死亡约600 000例。手术切除包括肝脏部分切除术和肝移植术,是目前唯一有可能根治HCC的方法。然而,术后肿瘤复发成为影响肝癌患者预后的主要因素之一,现多认为其与术后残余肝脏中的肝内微小转移灶的播散或原发潜伏癌灶的复燃有关。肝脏再生是肝脏部分切除和肝部分移植术后经历的自然过程,也是肝脏外科医生术前必须考虑的因素,剩余健康肝脏的体积和再生能力制约着外科手术切除范围和患者的预后。肝脏外科的手术应激和缺血损伤以及术后肝脏再生过程伴随的细胞和分子生物学的改变,可能激活潜伏的微小癌灶、加速肿瘤的代谢和转移的进程。因此,权衡如何抑制肿瘤复燃、维持剩余肝脏功能并促进外科术后肝脏再生就成为临床肝脏外科的难点和重点。本研究首先假设肝脏部分切除术后肝内肝癌微小转移灶或原发潜伏癌灶的肝癌细胞增殖加速、侵袭性增强,并与切除体积相关。在建立大鼠肝脏部分切除术后肝内微小肝癌复发模型的基础上,探寻肝脏部分切除术、肝脏再生和肝癌复发之间的关系。然后,从肝癌活化、增殖与肝脏再生的分子机制的不同点入手,观察Sorafenib对不同肝细胞、肝癌细胞以及大鼠微小肝癌复发的影响,寻找抑制肿瘤和维持肝脏基本功能、促进肝脏再生的药物干预方案。最后,从肝癌、肝脏再生与干细胞理论的联系为切入点,进一步探究肝脏再生与微小肝癌复发的其演变及其机制,为抑制术后肿瘤复发、促进肝脏再生提供新的理论依据和治疗途径。材料和方法：Buffalo大鼠实施0%-80%不同体积的肝脏部分切除术,同时在肝右下叶被膜下种植含McA-RH7777肝癌细胞悬液(1.0×106/0.2ml)来建立肝脏切除术后微小肝癌复发模型,70%肝脏部分切除的大鼠作为对照。记录大鼠肝脏部分切除术后21天,大鼠的体重、肿瘤的体积和数量；术后第3、7和21天,血清肝脏功能指标和免疫染色法检测肝组织Cyclin D1和Ki-67来反映肝脏再生；术后21天,免疫染色法检测肿瘤和肝组织中甲胎球蛋白(a-fetoprotein, aFP)、Ki-67、Cyclin D1 Calpain-small subunit 1 (CAPNSl)、CD34和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等,比较肿瘤增殖情况和侵袭性。术后3、7和21天肝脏再生组织,CK19和αFP免疫荧光双重染色判定肝卵圆细胞活化状态。Sorafenib溶解于DMSO,配置成含0.1-10μM浓度梯度,DMSO按照0.1%(v/v)的浓度加入细胞培养液；通过3H-Thymidinine细胞增殖实验和MTT细胞活性实验比较Sorafenib对大鼠肝脏原代细胞和肝癌细胞系的体外增殖和细胞活性作用的差异,免疫染色法检测MAKT/AKT细胞信号传导通路活性的变化。大鼠活体实验中,Sorafenib溶解于混合的蓖麻油聚氧乙烯醚；70%肝脏部分切除术、在肝右下叶被膜下种植含McA-RH7777肝癌细胞的Buffalo大鼠,术后每日按照2.5和10mg/kg管饲Sorafeib(?)昆合液；术后21天,记录大鼠的体重、肿瘤的体积和数量,免疫染色法检测肿瘤组织中肿瘤指标(Cyclin D1、Ki-67、αFP、CD34和VEGF)的水平,血清肝脏功能指标和免疫染色法检测肝组织再生指标(Cyclin D1和Ki-67)来反映肝脏再生。结果：Ⅰ.实施肝脏部分切除术的大鼠,肿瘤体积显着性增加(P<0.05),与肝脏切除体积、肝脏再生程度正相关；随着切除体积的增加,肿瘤组织中Cyclin D1、αFP、Ki67、CAPNSl、CD34和VEGF等表达上调(P<0.05),肺浸润、转移的肿瘤细胞数量增加(P<0.05)。Ⅱ. Sorafenib和EGF培养的肝脏原代细胞活性、增殖能力和MAKT/AKT信号通路激酶活性均显着高于肝癌细胞McA-RH 7777、Bel 7402和HepG2细胞(p<0.05)；实施70%肝脏部分切除术和肝癌细胞种植的大鼠管饲Sorafenib后,在术后21天肿瘤体积、数量以及远处转移显着性减少(P<0.05),肝脏再生水平无变化(P>0.05)。Ⅲ.动态观察肝脏部分切除术后肝脏再生与微小肝癌复发的变化：在术后3-7天,出现肝脏再生峰值；术后7-21天,70%和80%肝脏切除组的肝脏卵圆细胞活化；术后7-21天,随着切除体积的增加,大鼠体重下降、肝脏功能恶化(p<0.05),肿瘤体积增加。结论：本研究使用0%-80%不同切除体积的大鼠肝脏部分切除术、在保留的肝右下叶种植肝癌细胞来建立大鼠肝脏部分切除术后微小肝癌复发模型,术后观察21天来模拟临床上肝脏切除术后潜伏的肝癌转移灶或原发性微小肝癌早期复发和转移。结果证实,微小肝癌增长和转移的程度与肝脏部分切除术的体积以及肝脏再生的程度有关。在肝脏再生促进肝癌术后微小肝癌增殖、转移的研究基础,利用肝肿瘤细胞和肝细胞MAPK/AKT细胞信号传导通路的表达差异,使用RAF靶向抑制剂Sorafenib抑制肿瘤的增殖和远处转移,对肝脏再生没有影响的条件下、有效。地抑制了处于增殖状态下的肿瘤细胞复发和转移,对肝癌术后的辅助治疗提供实验证据。通过对肝脏切除术后微小肝癌复发和肝脏再生情况的动态观察和对肝内肝脏干细胞的检测,证实了再生肝脏中肝干细胞的活化、与肝脏切除体积和肿瘤的侵袭性有关,推测肝脏干细胞可能参与了术后肝脏再生以及微小肝癌的术后肝内转移。这很可能为肝癌术后抑制肿瘤复发、促进肝脏再生提供了一条新的治疗思路。
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