CRISPR系统对脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用研究

论文摘要

由于创伤或肿瘤而引起的骨缺损是骨科、整形修复科、口腔颌面外科等科室的常见疾病,其严重影响患者的组织功能和外形。骨水泥或其他人工材料可以促进轻度的骨缺损愈合,而较大的骨缺损则需要血管化的骨移植进行修复。常用的方法有髂骨或腓骨瓣移植,其虽然可以修复大部分的骨缺损,但会导致供区损伤较大。因此,近年来迅速发展的组织工程和再生医学为修复或替换受损组织提供了新的思路,其中种子细胞是研究者的首选材料。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是干细胞的一种,能分化为间质组织,具有亚全能分化潜能,在特定的体内外环境下,能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞的自我更新的能力,是维持其终生具有分化潜能的基础。其多谱系分化能力,即可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞,为多种疾病的治疗提供了重要的原材料。以上两个特性使其在再生医学方面成为除诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）和胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）之外备受瞩目的干细胞来源。间充质干细胞可从成体各组织中获得,包括脂肪、骨髓、骨膜、松骨质、脐带及牙髓中,因易于分离、培养、扩增和纯化,且多次传代后仍具有干细胞特性,不存在免疫排斥的特性,被广泛应用于再生医学领域和自身免疫性疾病的治疗。此外,间充质干细胞因无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等优势,成为最具临床应用前景的多能干细胞。间充质干细胞按来源可分为:骨髓间充质干细胞,脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,胎盘间充质干细胞,脐带间充质干细胞等,相较于其他间充质干细胞,由于脂肪干细胞具有成来源充足、获取方便、创伤小及产量高、瘤危险性低、遗传稳定性、免疫原性低,可分泌各种细胞因子,促进血管形成,并能招募其他细胞参与重建,等优点被作为重要的种子细胞,因此本实验选取其作为研究材料。间充质干细胞的三系分化能力（成脂分化能力、成骨分化能力和成软骨分化能力）是决定间充质干细胞多能性的主要指标,等其中成骨分化能力在临床上被广泛应用于骨损伤的修复研究。之前,间充质干细胞的骨损伤修复大都是基于未分化的间充质干细胞的相关特性,之后,随着研究的深入,越来越多的报道显示分化后的间充质干细胞的组织替代和修复作用更强的特异性。因此借助特定的方法获得分化后的间充质干细胞在临床应用上具有深远的意义。目前,体外诱导干细胞定向分化,有多种方法,包括化合物法、转录因子诱导法以及小分子诱导法等。虽然这些方法可以有效的诱导间充质干细胞的分化,但其特异性有待提高。所以,快速精准地控制间充质干细胞的诱导分化对间充质干细胞的临床研究具有重要的意义。CRISPR-Cas9（Clusterregularlyinterspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR-Cas9）基因编辑技术,是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术,以其基因编辑的便利性、精准性和临床应用的可操作性已被广泛应用。有研究表明,失活的Cas9（deadCas9,dCas9）蛋白能够快速特异地操纵目的基因。与普通的外源性过表达相比,CRISPR-Cas9系统能够同时内源性的调控多个基因的特异性表达,从而对细胞的命运进行精准调控。间充质干细胞的成骨诱导分化和成脂诱导分化受到多种细胞因子和激素的调控,表现为一种相互关联和制约的平衡关系,涉及到的信号通路复杂,有研究表明:骨质疏松症就是因为成骨分化和成脂分化出现失衡,并以牺牲成骨细胞数量为代价的方式产生多的脂肪细胞。因此对其关系的研究将为间充质干细胞的临床治疗骨质疏松疾病提供一定的理论依据。本研究共分为三部分:第一部分脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定本章节通过运用酶解法和优化的组织贴壁法分离小鼠脂肪间充质干细胞,通过观察细胞形态学,检测体外增殖能力、流式表面标志物、成克隆能力（CFU）、以及成骨、成软骨和成脂诱导分化能力等,结果表明所获得的细胞具有很强的体外增殖能力,且经过长期传代后增殖能力无明显改变;流式表面标志物CD44和CD90表达阳性;对诱导分化后的成骨细胞、软骨样细胞和脂肪细胞等染色表明所分离到的细胞具有多向分化潜能,进一步证实所分离的细胞为脂肪间充质干细胞。从而建立了一套稳定的体外分离、培养、鉴定及诱导分化体系。第二部分CRISPR系统介导脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化本章节通过利用CRISPR系统对脂肪间充质干细胞中的两个成骨前体基因Runx2和Osterix进行内源性的瞬时过表达,观察其对MSCs成骨诱导分化能力的影响。RT-qPCR结果显示,内源性的过表达两个成骨前体基因可以迅速使得MSCs朝着成骨方向诱导分化;茜素红染色结果显示,内源性的瞬时过表达两个成骨前体基因显著提高了成骨的诱导分化效率。此外,对成骨分化过程中的OPN、OCN及Coll-I等基因进行检测,结果显示,内源性过表达Runx2和Osterix后,以上基因表达水平迅速上调,继而加速进入成骨分化阶段。这种利用基因工程手段快速改变MSCs命运的方法为临床应用奠定了坚实的基础,同时为MSCs的成骨诱导分化的特异性指明了方向。第三部分CRISPR系统促进间充质干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究本章节通过利用CRISPR系统内源性的过表达成骨前体基因Runx2和Osterix,观察脂肪间充质干细胞的命运状态,着重分析CRISPR系统对ASCs成骨分化特异性的调控和在成骨分化过程中对成脂分化的影响,实验结果表明:成骨前体基因Runx2和Osterix表达水平上调,PPARγ、LPL等成脂相关基因表达水平下调。这一结果进一步证实了CRISPR系统内源性的过表达成骨前体基因Runx2和Osterix能够促进脂肪间充质干细胞的成骨分化,同时抑制其成脂分化,对成骨诱导分化和成脂诱导分化具有特异性作用,为探索间充质干细胞的成骨分化与成脂分化之间的复杂关系奠定理论基础,为间充质干细胞在骨性疾病的临床治疗方面提供思路。综上,本论文初步建立了一套稳定脂肪间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定体系;利用CRISPR系统对分离的脂肪干细胞中的Runx2和Osterix两个成骨相关的前体基因进行内源性过表达,可加速其脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化,抑制成脂诱导分化,阐明了成骨和成脂诱导分化的相互联系,为MSCs的成骨诱导分化的特异性指明了方向,为后期临床应用研究奠定了一定的基础。

论文目录

摘要

summary

主要英文缩略词对照表

第1章前言

1.1 问题的提出

1.2 选题背景及意义

1.3 文献综述

1.3.1 间充质干细胞的来源与定义

1.3.2 间充质干细胞的体外分化能力

1.3.3 间充质干细胞成骨分化的基因调控网络

1.3.4 CRISPR/Cas9 系统

1.4 技术路线

1.5 论文结构

第2章脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 间充质干细胞的分离与培养

2.2.2 小鼠脂肪间充质干细胞的传代培养

2.2.3 脂肪间充质干细胞的冻存

2.2.4 脂肪间充质干细胞的复苏

2.2.5 脂肪间充质干细胞表面标识物鉴定

2.2.6 脂肪间充质干细胞克隆形成能力实验及结晶紫染色

2.2.7 脂肪间充质干细胞生长曲线的测定

2.2.8 脂肪间充质干细胞细胞周期检测

2.2.9 脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化及油红O染色

2.2.10 脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化及阿利新蓝染色

2.2.11 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色

2.3 实验结果

2.3.1 酶解法对小鼠脂肪间充质干细胞的分离和培养

2.3.2 酶解法ASCs表面标志物的鉴定

2.3.3 酶解法ASCs生长曲线检测

2.3.4 酶解法ASCs多向分化潜能的鉴定

2.3.5 优化的组织贴壁法分离脂肪间充质干细胞

2.3.6 组织法ASCs表面标志物的鉴定

2.3.7 组织法ASCs的细胞周期检测

2.3.8 两种分离方法的克隆形成（CFU）能力对比

2.3.9 两种分离方法的三系分化能力对比

2.4 讨论与小结

第3章 CRISPR系统介导脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

3.1 实验材料

3.1.1 实验细胞

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 sgRNA的设计

3.2.2 分子克隆与质粒构建

3.2.3 脂肪间充质干细胞的转染

3.2.4 细胞全RNA的提取、反转录及荧光实时定量PCR（RT-qPCR）

3.2.5 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色

3.3 实验结果

3.3.1 sgRNA的验证

3.3.2 CRISPR/dCas9 系统介导成骨前体相关基因内源性过表达

3.3.3 CRISPR/dCas9 系统激活内源性成骨前体基因对成骨诱导能力的影响

3.3.4 CRISPR系统对成骨分化相关基因的影响

3.4 讨论与小结

第4章 CRISPR系统促进成骨分化与抑制成脂分化的研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验细胞

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 sgRNA的设计

4.2.2 脂肪间充质干细胞表面标识物鉴定

4.2.3 脂肪间充质干细胞克隆形成能力实验及结晶紫染色

4.2.4 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色

4.2.5 脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化及油红O染色

4.2.6 细胞全RNA的提取、反转录及荧光实时定量PCR（RT-qPCR）

4.3 实验结果

4.3.1 CRISPR-d Cas9 介导的过表达没有改变小鼠脂肪间充质干细胞的特性

4.3.2 CRISPR系统促进成骨诱导分化

4.3.3 CRISPR系统促进成骨分化的同时抑制成脂诱导分化

4.4 讨论与小结

全文结论

参考文献

致谢

导师简介

个人简历及博士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杨馥如

导师: 余四九,王学智

关键词: 脂肪间充质干细胞,成骨诱导分化,系统

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 甘肃农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000261

总页数: 82

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CRISPR系统对脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用研究

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