猪流行性腹泻病毒流行毒株感染性克隆的构建及应用

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的一种以肠炎、急性水样腹泻、脱水、呕吐、体重减轻和精神萎靡等典型症状为特征的急性传染性疾病,不同日龄的猪均易感染,且新生仔猪的发病率和死亡率高达80%-100%。自2010年以来,以S基因变异为主要特征的PEDV毒株在全国范围内暴发,给我国养猪业造成了严重的经济损失。根据S基因进化树分析,我国流行的PEDV强毒力变异毒株属于GII型,该类毒株主要特征是相比于经典毒株,在其S基因中存在着不同程度的插入、缺失或碱基的置换等突变,并导致基于GI型PEDV CV777毒株的传统疫苗无法提供有效的保护。因此,在体外分离GII型毒株对研究PEDV的分子生物学特征、致病机制及新型有效疫苗的研制具有重要作用。此外,为了进一步研究PEDV流行毒株的分子致病机制,以前期分离的流行毒株为亲本建立反向遗传操作平台就显得十分必要。本研究将采集自河北的PEDV阳性样品接种于Vero细胞,经过连续体外传代培养,成功的在体外分离到了GIIa基因型CH/HBXT/2018毒株。CH/HBXT/2018毒株能够在Vero细胞上稳定传代并产生典型的细胞病变（CPEs）,仔猪致病性试验结果显示该毒株在仔猪中具有很强的致病性,能够引起较高的感染率和死亡率,并伴随着呕吐、腹泻、极度消瘦和其他典型的临床症状。半数仔猪腹泻量(The median pig diarrhea dose,PDD50)在攻毒后7天可达到8.63 PDD50/3 mL。该毒株的成功分离为今后研制新型、有效的PEDV疫苗奠定了材料基础。此外,以上述分离到的GIIa型PEDV CH/HBXT/2018毒株及实验室先前保存的GIIb型PEDV CH/HNPJ/2017毒株为亲本,利用体外连接技术对两株流行毒株进行了病毒基因组全长的构建。首先将两株毒株的全长基因组分为六个相邻的DNA片段并获得相应的克隆,并在A片段5′端和F片段3′端分别引入T7启动子序列和PolyA结构。然后利用限制性内切酶及T4 DNA连接酶,并通过体外转录的方法成功获得了PEDV CH/HNPJ/2017和PEDV CH/HBXT/2018毒株基因组cDNA克隆,为进一步拯救病毒和反向遗传平台的构建及应用奠定了基础。

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摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 猪流行性腹泻概况

1.1.1 猪流行性腹泻的流行、传播及现状

1.1.2 猪流行性腹泻病毒基因组结构和蛋白质功能

1.1.3 猪流行性腹泻的诊断与预防

1.1.4 猪流行性腹泻疫苗研究进展

1.2 冠状病毒反向遗传学研究进展

1.3 本研究的目的与意义

第二章 PEDV毒株的分离鉴定及致病性分析

2.1 材料

2.1.1 病料、细胞、载体及菌株

2.1.2 主要实验试剂

2.1.3 细胞培养液及细菌培养基等的配置

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 分子生物学分析软件

2.2 方法

2.2.1 细胞与临床样品

2.2.2 病毒分离与传代

2.2.3 PEDV全基因组序列测定

2.2.3.1 RNA提取

2.2.3.2 PCR引物设计

2.2.3.3 RT-PCR、PCR及产物回收

2.2.3.4 克隆反应及序列测定

2.2.4 S基因序列测定及遗传进化分析

2.2.5 病毒TCID50 的测定

2.2.6 生长曲线

2.2.7 病毒粒子的电镜观察

2.2.8 免疫荧光（IFA）

2.2.9 仔猪致病性实验

2.2.10 组织病理学和免疫组化（IHC）

2.3 结果

2.3.1 PEDV毒株的分离与鉴定

2.3.1.1 PEDV毒株的分离

2.3.1.2 PEDV分离毒株的IFA鉴定

2.3.1.3 PEDV分离毒株的复制动力学分析

2.3.1.4 PEDV分离毒株的病毒粒子电镜观察

2.3.1.5 PEDV分离毒株的全基因扩增

2.3.1.6 PEDV分离毒株S基因遗传进化分析

2.3.2 PEDV 分离毒株的致病性实验

2.3.2.1 CH/HBXT/2018 毒株的感染滴度和毒力

2.3.2.2 CH/HBXT/2018 毒株在仔猪上的致病性分析

2.4 讨论

2.5 结论

第三章 PEDV流行毒株感染性克隆的构建及应用

3.1 材料

3.1.1 病毒和细胞

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要实验仪器和设备

3.2 方法

3.2.1 体外连接技术拯救病毒的策略

3.2.2 PCR引物设计

3.2.3 各个目的片段的制备

3.2.4 目的片段的体外连接

3.2.5 体外转录

3.2.6 RNA的回收和定量

3.2.6.1 RNA产物的回收和纯化

3.2.6.2 RNA产物的定量

3.2.7 RNA的凝胶电泳分析

3.2.7.1 RNA凝胶的制备

3.2.7.2 RNA样品的制备

3.2.8 体外转染

3.2.9 拯救病毒分子遗传标记的验证

3.3 结果

3.3.1 目的片段的获取

3.3.2 目的片段的体外连接、体外转录

3.4 讨论

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张莉萍

导师: 王永录

关键词: 猪流行性腹泻病毒,克隆,病毒拯救,强毒力变异毒株

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: “国家自然科学基金青年基金项目(项目批准编号:31602095)”,“现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-35)”

分类号: S852.651

总页数: 51

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