活细胞的太赫兹波谱特征研究及无标记超材料传感芯片的构建

论文摘要

背景:作为构成生命体的基本结构单元,细胞的功能与结构解析是生命科学研究的关键。解析活细胞的检测技术可分为有标记检测和无标记检测技术。活细胞有标记检测技术主要以荧光素、核素等标记分子为基础,是细胞生物学研究的核心技术,可在分子层面揭示细胞和组织器官的病理生理特征。但其标记过程可能影响靶分子的结构和功能,且操作过程较为繁琐,难以还原细胞本征状态下的特征信息。以解析活细胞生物物理特征（力学、电学及光学特性）为代表的无标记检测技术可揭示细胞增殖、分裂、凋亡和相互作用等基本生命过程的特征信息,在临床检验诊断的血液细胞分析和循环肿瘤细胞检测、表型分析及药敏分析中具有巨大的应用价值。目前仍需拓展活细胞生物物理特性研究的深度和广度,完善和增加活细胞无标记检测的方法体系,从而为临床检验诊断、药物筛选、食品健康和环境毒性评估等成熟产业化应用场景提供多元、丰富的检测平台。太赫兹(Terahertz,THz,1 THz=1012Hz)波技术是当前生物物理学交叉领域的研究热点,相比于力学、电化学和光学等传统活细胞无标记检测技术具备以下独特优势:（1）THz波可检测分子低频集体振动模式,特别是细胞基因组甲基化状态的特征振动模式位于THz波段内（1.6 THz）;（2）THz波可获取胞内分子皮秒及亚皮秒尺度的水化动力学参数;（3）THz波检测速度快,可用于医学成像,特别是在体状态下无标记检测;（4）THz波是非电离探测,不会损伤待检细胞的生物活性。目前,THz衰减全反射（THz attenuated total reflection,THz-ATR）技术和超材料技术是检测活细胞的主流方法,可解决活细胞THz检测中面临的培养基吸收过强和尺度灵敏度失匹配问题,已用于无标记解析活细胞胞内水化动力学模式参数以及检测活细胞通透性改变过程、抗肿瘤药物诱导凋亡过程和氧化应激状态等活细胞的病理生理特征模式,显示出在细胞无标记检测领域的广阔前景。但现有活细胞THz-ATR研究平台需要将细胞接种于棱镜表面并贴壁生长,造成其检测通量低（单次仅能检测一个样本）,检测周期长（细胞贴壁生长为单细胞层需要48 h）,且需要在棱镜表面设置微型细胞培养室。THz超材料芯片具有高灵敏、便携小巧等优势,可反应细胞病理生理状态改变过程中相对复介电环境的变化。由于水对THz波的强烈吸收,目前透射式THz超材料芯片检测细胞时均需拭去细胞外培养基,可能对活细胞的生理状态产生影响。最后,恶性肿瘤细胞的代谢状态特征改变常发生于细胞形态学变化之前;细胞的葡萄糖代谢途径和胞内葡萄糖含量是区分肿瘤细胞和正常细胞代谢状态的重要特征。但由于水的强烈衰减作用,THz波尚无法特异检测液相环境中葡萄糖分子。本研究针对上述THz-ATR平台和超材料芯片用于活细胞检测所面临问题,首先探索在薄膜介质面（Transwell培养室薄膜下层）形成单细胞层的培养方式,并构建THz-ATR薄膜传感平台提取薄膜下层细胞复介电信息的算法模型,分离细胞培养生长和细胞检测过程,实现活细胞的无标记、快速检测。区别于既往研究中超材料透射模式下去除胞外水的测量方式,本研究采用高灵敏、便携的THz超材料构建液相细胞传感芯片,结合仿真模拟和实验测量探索反射模式和自参考信号处理方式用于活细胞检测的可行性;初步构建快速、便捷的THz活细胞无标记超材料传感芯片。同时,着力优化上述活细胞超材料传感芯片的偏振依赖性和反射峰强度,进一步设计基于超强光透射（Extraordinary optical transmission,EOT）效应的偏振不敏感型圆环狭缝超材料细胞芯片阵列,全方面评估该芯片阵列检测细胞密度分布、凝血酶刺激形态变化、不同恶性程度细胞和药物诱导肿瘤细胞凋亡的可行性。最后,针对THz液相检测葡萄糖溶液特异性匮乏问题,将THz技术的水敏感性和响应性水凝胶的水含量特异变化特性有机结合,构建水凝胶功能化THz超材料芯片。通过以上工作,本研究构建一套互补长短,灵活搭配的活细胞THz研究平台和检测方法,即全方位获取活细胞复介电信息的THz-ATR薄膜传感平台和高灵敏、便携化THz超材料细胞传感系统,并研发可特异定量检测葡萄糖溶液的水凝胶功能化的THz超材料芯片,为THz波技术走向临床检验诊断中循环肿瘤细胞分析及体液中靶分子特异检测提供一条切实可行的研究途径。方法:1.THz-ATR薄膜传感技术检测活细胞波谱特征及细胞迁移能力的研究:使用激光共聚焦显微镜获取人正常宫颈上皮细胞株HCer Epi C、宫颈癌前病变细胞株Ect1/E6E7、和宫颈癌细胞株Hela的厚度信息,构建THz-ATR薄膜传感平台,优化两界面模型获取薄膜下细胞层复介电信息的数据处理方法,提取并对比以上三种细胞的THz复介电常数信息差异。在Transwell小室中接种饥饿处理24 h的Hela细胞,使用不同体积分数胎牛血清（1%,2.5%,5%,10%）作为趋化因子,利用上述THz-ATR平台检测迁移进入小室下层的Hela细胞密度分布情况,并与结晶紫染色分析法进行方法学比对,从而评估细胞迁移能力。2.自参考模式的THz超材料细胞传感芯片的研究:在高阻硅基底上制备四开口方形谐振环的THz超材料芯片,使用时域有限差分（Finite difference time-domain,FDTD）分析液相环境中超材料上细胞层和培养基的响应波谱、超材料表面电场分布与细胞层厚度饱和响应关系以及细胞层水含量变化时的响应特征,通过实验获取超材料表面犬肾细胞MDCK密度变化和皂素诱导通透性改变时谐振峰的变化情况;并分析超材料芯片谐振峰幅值与谐振环上细胞数目的关系。3.偏振不敏感型THz超材料细胞传感阵列的研究:加工基于EOT效应的圆环狭缝型超材料芯片,结合自行设计的配套夹具模块组装成2×3孔型细胞传感阵列。使用FDTD仿真研究液相环境下细胞层水含量变化时的响应特征以及该芯片的敏感响应区域,并检测人脐静脉内皮细胞HUVEC密度分布、凝血酶诱导HUVEC细胞形态变化、不同恶性程度宫颈细胞和多西他赛诱导宫颈癌Hela细胞凋亡变化,并将CCK-8计数法作为细胞密度和凋亡检测的对比方法。4.葡萄糖敏感水凝胶的THz波谱特征及功能化THz超材料芯片的构建:采用紫外交联法制备葡萄糖敏感水凝胶,并用称重分析法优化3-丙烯酰胺基苯硼酸（3-（acrylamido）phenylboronic acid,AAPBA）含量,联合THz-ATR测量和称重分析法获取梯度浓度葡萄糖溶液中响应性水凝胶的THz吸收波谱和水含量变化情况,并拟合分析吸收波谱改变和水凝胶的水含量变化关系,获取该传感方法定量检测葡萄糖溶液的灵敏度、干扰度和重复性。使用铝箔垫片在THz圆环狭缝型超材料芯片表面制备20μm厚的水凝胶薄膜层,获取梯度浓度葡萄糖溶液环境中该超材料芯片的谐振峰响应特征,并进行性能评估。结果:1.获取了正常宫颈上皮细胞株HCer Epi C、宫颈癌前病变细胞株Ect1/E6E7、和宫颈癌细胞株Hela的THz吸收系数、折射率、复介电常数实部和虚部的频谱参数,三株细胞与培养基溶液差异集中在复介电常数虚部和吸收系数,且三株细胞间在0.5-1.2THz波段内存在吸收差异,呈现随细胞恶性程度增加介电损耗和吸收增强的趋势。Transwell迁移实验中不同体积分数胎牛血清作用的小室下层Hela细胞分布密度不同,对应THz吸收系数随细胞分布密度的升高而降低,其变化趋势与结晶紫染色分析结果线性相关性好,R2=0.99107。2.反射式自参考型THz超材料细胞传感芯片在液相环境下谐振峰响应信号与模拟信号吻合度较高,谐振峰位于0.9 THz附近,相对幅度变化约12%,相较无任何高阻硅结构的情况可获得约10倍信号增强。该传感方式中谐振峰不受溶液层厚度影响（厚度大于100μm时）,在常见细胞厚度范围内（5–20μm）可有效检测细胞水含量改变引起介电损耗变化。该传感芯片无需参考芯片测量,可实现对皂素诱导细胞通透性变化过程的无标记、实时监测,可观察到皂素与细胞膜整合过程的平台期及浓度依赖性谐振峰幅度变化,在用于评估超材料芯片表面细胞密度分布情况时,谐振峰幅度变化与谐振环上细胞平均数目变化的线性相关性较好,R2=0.9914。3.构建的圆环狭缝型超材料芯片阵列谐振峰响应信号与模拟信号吻合度好,谐振峰位于0.5 THz附近,细胞和培养基的相对幅度变化约21%。模拟结果显示谐振峰可有效响应细胞水含量变化过程中介电损耗的改变,其幅度变化和水含量变化的线性相关性较好,R2=0.9995。同时,该超材料芯片的增强电场主要位于狭缝内部附近,在狭缝中心覆盖宽度在0–10μm间变化的细胞模拟层时,谐振峰幅值响应随之呈现指数变化趋势;且10μm宽度的细胞模拟层可引起超过90%的谐振峰幅值变化。与之对应,该传感芯片阵列可无标记实时监测具有浓度依赖特性的凝血酶诱导HUVEC细胞形态变化过程。不同恶性程度细胞的谐振峰幅值各不相同,幅值变化与THz-ATR所获得细胞消光系数变化趋势接近。同时该传感芯片阵列检测细胞密度变化状态和多西他赛诱导细胞凋亡变化中的信号响应趋势与CCK8细胞计数分析法的线性相关性较好。4.紫外交联法制备的葡萄糖敏感水凝胶中AAPBA最优质量分数为9%,该水凝胶的水含量（称重法测量）随葡萄糖浓度升高而上升,对应的THz吸收系数也依次升高。不同浓度葡萄糖溶液中水凝胶水含量变化程度与1 THz处吸收系数变化趋势间的线性相关性较好,整合响应性水凝胶的THz-ATR平台检测葡萄糖溶液的最低检测限为16.18mg/d L;在80 mg/d L葡萄糖溶液环境下,可明显排除生理浓度乳酸,果糖,半乳糖的干扰,重复性良好。构建的水凝胶功能化超材料芯片的谐振峰随葡萄糖溶液浓度的升高而逐渐上升,最低检测限为3.92 mg/d L,抗干扰能力和重复性均较好。结论:1.THz-ATR薄膜传感平台可高通量检测薄膜下层的活细胞,活细胞的复介电常数虚部与细胞恶性程度相关,即肿瘤细胞分子水化状态、代谢活性和水含量均有升高;这可为循环肿瘤细胞的无标记分析提供新思路。THz-ATR技术可在1 min内无标记评估Transwell小室下层细胞分布密度,有望开发出系列无标记分析Transwell侵袭和迁移实验的新方法。2.开发的反射模式下自参考型THz超材料细胞芯片可有效获取液相环境中活细胞的特征信号,并可有效检测细胞通透性改变和密度分布变化,全程无需参考信号测量,适宜于长程连续监测,可为构建整合入常规培养体系的THz超材料细胞芯片提供借鉴。3.圆环狭缝型THz超材料细胞传感芯片阵列对THz极化状态不敏感,有利于实际操作,可有效获取液相环境中细胞特征信号;敏感响应区域集中于圆环狭缝附近,有助于监测亚细胞尺度的形态变化,可用于无标记检测细胞密度分布、形态改变、恶性程度及凋亡变化,有望开发出一种无标记、便捷高效的循环肿瘤细胞检测和药敏分析装置。4.THz-ATR技术可无标记检测响应性水凝胶在葡萄糖溶液中特异溶胀变化过程。葡萄糖敏感水凝胶功能化的THz超材料芯片最低检测限为3.92 mg/d L,可整合入THz超材料细胞芯片阵列用于细胞葡萄糖代谢和含量分析;并具备开发出高生物相容性、高特异和高灵敏的THz生物传感器的巨大潜力;这为解决THz液相传感面临特异性匮乏问题提供一条行之有效的解决方式。

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缩略语表

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第一章前言

1.1 细胞无标记检测的意义及研究现状

1.2 THz波技术无标记检测细胞的优势与现状

1.3 THz波技术与响应性水凝胶结合契机

1.4 本研究拟开展的工作

第二章 THz-ATR薄膜传感技术检测活细胞波谱特征及细胞迁移能力的研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章自参考模式的THz超材料细胞传感芯片的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章偏振不敏感型THz超材料细胞传感阵列的研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第五章葡萄糖敏感水凝胶的THz波谱特征及功能化THz超材料芯片的构建

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

5.4 小结

全文结论

参考文献

文献综述太赫兹波成像技术的临床应用研究进展

参考文献

攻读学位期间研究成果

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 赵祥

导师: 府伟灵

关键词: 太赫兹,衰减全反射,细胞传感,超材料,水凝胶

来源: 中国人民解放军陆军军医大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技,信息科技

专业: 物理学,临床医学,无线电电子学

单位: 中国人民解放军陆军军医大学

基金: 国家重点基础研究计划(",973",计划)(No.2015CB755400),国家自然科学基金重点项目(No.81430054),军队后勤科研重大项目(No.AWS17J010)

分类号: O441.4;R446

DOI: 10.27001/d.cnki.gtjyu.2019.000161

总页数: 137

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