维氏气单胞菌TH0426 rpoN与rpoE基因缺失株的构建及功能的初探

论文摘要

维氏气单胞菌（Aeromonas veroni,A.veronii）是一种重要的人—兽—水生动物共患致病菌,研究显示近来毒力呈逐年上升趋势,已被越来越多的学者重视,但对于A.veronii毒力方面研究较少,对于毒力基因的研究有助于对A.veronii的致病机制的研究提供理论依据。对于rpoN基因的研究最早见于1985年,近年来有关rpoN的研究报道逐年增多,它能够控制多个功能基因的转录表达,包括氮代谢、逆迫应答、碳源利用、运动及毒力等基因的表达,在很多细菌中发挥至关重要的作用。因此试验选取rpoN基因作为敲除对象,应用基于自杀性质粒的同源重组技术分别构建A.veronii TH0426株rpoN的缺失株△rpoN,以及其互补株C-rpoN,并对上述菌进行部分生物学特性分析。结果显示,在生长曲线、溶血活性方面,三者未见明显区别;菌落形态上,缺失株△rpoN呈明显波浪状边缘,互补株C-rpoN恢复至野生株表面光滑,边缘整齐的状态;斑马鱼半数致死量测定结果显示缺失株△rpoN的LD50比野生株升高了22.9倍,小鼠的LD50升高3.06倍,毒力显著下降;生物被膜形成能力检测结果显示缺失株△rpoN较野生株而言减弱,相差11倍,回补株有所增强,但同样没有恢复到野生株水平;对细胞的黏附与侵袭和对EPC的毒性也有所下降;游动能力检测结果显示野生株TH0426有鞭毛,具有游动能力,而缺失株△rpoN的游动能力基本丧失,通过进一步鞭毛染色试验结果可观察到,野生株TH0426具有极性鞭毛,每个菌体有一根,而缺失株△rpoN未见明显鞭毛,互补株C-rpoN视野中存在少量断裂鞭毛。rpoE是菌体抵御外界不利环境下引起逆迫应答的关键因子,通过调控基因表达量来调控菌体活性,协助细菌产生御热应答,以此抵抗恶劣环境,对于菌体的生存有着至关重要的影响。因此依靠相同方法对rpoE进行敲除,通过生物学特性分析,结果显示缺失株△rpoE与野生株相比溶血活性无变化,菌落形态无明显变化,但生长速度较野生株慢;生物被膜检测缺失株△rpoE较野生株下降3.7倍;黏附与侵袭能力也较野生株下降,缺失株△rpoE对斑马鱼的LD50比野生株升高了82.3倍,小鼠的LD50升高了5.22倍;同样细胞毒性试验结果显示,缺失株△rpoE在对EPC的毒性明显弱于野生株TH0426;运动能力检测结果显示在半固体培养基中,缺失株△rpoE基本丧失运动能力,在鞭毛染色结果中△rpoE无明显鞭毛。综上所述,本试验通过构建A.veronii TH0426株rpoN和rpoE的缺失株及互补株并对其与野生株的生物学差异进行比对分析,推测rpoN和rpoE的功能,研究结果对于A.veronii致病机制的研究奠定基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王冬雪

导师: 孟庆峰

关键词: 维氏气单胞菌,生物学特性,基因敲除

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,水产和渔业

单位: 吉林农业大学

基金: “国家重点研发计划项目(2017YFD0501000)”,“吉林省科技厅自然科学基金项目(20170101016JC)”,吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20180694KJ)

分类号: S941.4;S852.61

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000649

总页数: 70

文件大小: 4127K

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