郝艳秋[1]2003年在《人肝再生增强因子基因克隆、表达、生物活性及应用研究》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)是一种特殊的促肝细胞分裂原，在肝损伤修复过程中起重要的作用。 肝脏疾病是危害人类健康的重大疾病之一。我国的肝炎、肝硬化及肝癌患者人数在1亿左右。且发病率在逐年上升，据1999年统计，发病率在12％左右。因此，为解除肝病患者的痛苦，研究一种医治肝病的新药迫在眉睫。1987年以来，我国学者应用胎肝的混悬液，治疗各种肝病取得了明显的疗效。由此启发并说明胎肝中含有肝细胞的增殖刺激因子。1994年Hagiya等人从初断乳大鼠的肝胞液中分离出一种能促进肝细胞增殖的一种热稳定性细胞因子，命名为肝细胞再生增强因子。 本论文应用基因工程的手段克隆、表达并纯化了人的肝再生增强因子基因(hALR)。为进一步研究它的生物学功能打下了基础。并通过建立大鼠肝纤维化模型和小鼠的脂肪肝损伤的模型，较系统的研究了基因克隆方法获得的人肝细胞再生增强因子基因的生物活性，为使hALR尽早应用于临床治疗肝病奠定了基础。结果如下： 1．首次从6个月胎肝中提取hALR基因的总的RNA，采用RT-PCR的方法克隆了hALR的完整阅读框的cDNA片段。由测序结果得知，重组子片段是由378个碱基组成的，有2个碱基发生了突变，未导致氨基酸发生变化。 2．首次构建了重组ALR原核表达载体，获得了pET28a-hALR的重组表达质粒，并测序证实。 3．首次对pET28a-hALR基因进行了IPTG梯度的诱导表达，不同浓度的诱导剂IPTG诱导表达表明，当IPTG浓度为1M时，表达量最高；首次对pET28a-hALR基因进行了时间梯度的诱导表达。经过不同时间的诱导表达表明，诱导时间在3小时时表达量最高。 4．首次对pET28a-hALR基因表达部位进行了分析。原核表达的蛋白质无论在沉淀中还是在上清中均有表达。在沉淀中较在上清中表达得多。即蛋白质在大肠杆菌细胞内表达量大，而且主要是以包含体的形式存在。 5．通过表达蛋白质的免疫印迹检测(Western-blot检测)，证明表达出了18.7KD的融合型目的蛋白。Westen-blot杂交显色反应，结果在20.1KD附近有一明显的黑色斑点，正是hALR与其抗体结合后所表达的目的蛋白。 6．用NI离子交换树脂对表达的pET28a-hALR蛋白质进行了纯化。纯化的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，证明了目的蛋白被纯化出来了。 7．首次通过建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，研究rhALR对肝纤维化的生物活性作用。结果表明，rhALR对免疫损伤性大鼠肝纤维化的组织增生有明显的抑制作用，在免疫性肝纤维化过程中，给予rhALR可使血清中ALT，AST，LDH水平明显降低。保护了人血白蛋白所致的大鼠肝细胞的慢性免疫性损伤。 8．首次通过建立乙硫氨酸引起的小鼠的脂肪歼损伤的模型，观察rhALR对脂肪肝损伤的生物活性作用。结果表明，rhALR可抑制小鼠脂肪肝时ALT，AST，LDH活性升高，同时降低TG、TCH的含量，hALR对乙硫氨酸引起的小鼠脂肪肝有治疗作用。 东北农业大学理学博士学位论文一 9．通过基因工程的方法可以大量的生产11Hut，不仅大大陶氏了成本，而且克服了生u剂的缺点：纯度低、含杂质、成本高、易出现过敏反应等。同时也解决了胎肝来源受限的问题。为重组人肝再生增强子基因的药品开发和临床应用奠定了 出。 10利用酶联免疫吸附的方法检测不同类型肝病患者血清中ALR水平。尝试了一种较快速的检现9 患者血清中ALR水平的方法。本实验结果表明，肝病患者血清中影氏可检测到 ALR水平的浓度为 0．2 u叭，最高是9．2 u g／L。发现ALR抗体与 ALR抗原反应呈较好的线性正相关。提示ELISA j3i：．；y测外周血清中ALR水平具有良好的敏感性和特异性。
马玉珍[2]2004年在《用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究》文中研究表明本文在制备人肝再生增强因子转基因绵羊的上游工程中，利用绿色荧光蛋白作为选择标记，通过体细胞核移植技术建立细胞、胚胎水平上的转基因阳性筛选体系。该体系的建立在生产转基因绵羊的过程中可减少代孕母畜数量，降低成本，提高转基因效率。 1．绿色荧光蛋白和人肝再生增强因子基因真核表达载体的构建 利用分子生物学技术分别从人和绵羊基因组DNA中克隆了人肝再生增强因子(Human of liver regeneration, ALR)基因组DNA和绵羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因5’端0.8kb DNA序列，从pEGFP-C1质粒中克隆了增强绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein, EGFP)基因及其表达调控元件，构建了以下叁种真核表达载体：(1)ALR基因乳腺特异表达，EGFP基因非组织特异性表达载体，pGEM-BAE。(2)ALR和EGFP基因双顺反子表达载体，pIRES-EGFP／ALR。(3)ALR和EGFP融合基因表达载体，pEGFP／ALR。经PCR和酶切检测，证明载体构建正确，为下一步转基因绵羊的研究奠定了基础。 2．绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养及转基因条件的优化 取6个30天左右的绵羊胎儿，从中成功分离、培养了绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells, sFFCs)。测定了sFFCs的G418敏感浓度，sFFCs的G418筛选浓度为800ug／ml，维持浓度300ug／ml。另外分别优化了两种转染试剂LipofectAMINE~(TM)和Fegene-6转染sFFCs的条件，比较了DNA纯度、浓度、转染试剂用量及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响，LipofectAMINE~(TM)转染sFFCs较为适宜的条件是，LipofectAMINE~(TM)10ul, DNA 2ug, 马玉珍用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究共作用时间shr，转染效率为每视野42个荧光细胞，Fegene一6转染SFFCs较为适宜的条件，Fegene一6 6ul，DNA Zug，共作用时间12hr。转染效率为每视野19个荧光细胞。转染结果表明:对于绵羊胎儿成纤维细胞，LipofectAM工NE丁“转染效率较好，为目的基因转染SFFCS提供了参考依据。 3.绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响及绵羊胎儿成纤 维细胞性别鉴定 LipofeetAMINETM介导pEGFP一Cz转染体外培养的6只绵羊胎儿SFFCS，经G418筛选12天，挑选发绿色荧光的单克隆细胞扩大培养23天(转基因后共培养35天)，进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析。结果表明，整合有EGFP基因的SFFCS与对照组细胞比较，在细胞形态、生长曲线、染色体正确核型率上无明显差别。同时利用PCR方法对体外培养的6只绵羊胎儿的SFFCS进行性别决定区(seX determining region of、hey，sRY)基因检测，以明确SFFCs性别。结果显示:6只绵羊胎儿成纤维细胞中，其中2只为雌性胎儿细胞、4只为雄性胎儿细胞，对SRY基因的分析与染色体分析结果一致，明确了sFFCS的性别，可通过体细胞核移植进行己知性别的转基因克隆绵羊的研究。 4.绿色荧光蛋白和肝再生增强因子融合基因在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达 利用LipofectAMINE，加介导线性化pEGFP/ALR质粒转染SFFCS。经G418筛选，10d后共形成38个单克隆细胞，其中23个克隆发荧光，15个克隆不发荧光。挑选3个荧光细胞克隆和3个不发荧光的细胞克隆扩大培养，用PCR、聚丙烯酸胺凝胶电泳及免疫组化检测。结果表明:3个荧光单克隆细胞均有ALR、Neor基因的PCR产物，聚丙烯酞胺凝胶电泳可见57KD大小的融合蛋白，免疫组化检测到ALR蛋白分布于SFFCS胞质和胞核，且胞核含量多于胞质;3个非荧光单克 内蒙古大学博士学位论文隆细胞中不仅有ALR、EGFP、Neor基因PCR条带，而且其中的1个克隆还有融合蛋白。荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在sFFCS中的分布与ALR分布一致。由此可见，ALR、EGFP融合基因能够在SFFCS中表达，通过绿色荧光可确定ALR在细胞内的表达部位。 5 .EGPP和ALR双顺反子表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞及体细胞克隆产 生转基因囊胚 以Lipofe。tAMINE仪介导线性化pIRES一EGFP/ALR质粒转染sFFCs，经G418筛选，12天后形成43个细胞单克隆，其中发荧光的27个。挑选其中的3个荧光细胞单克隆进一步扩大培养，分别进行PCR、RT一PCR及免疫组化检测。结果表明:ALR基因在荧光单克隆细胞中存在并表达，而且与EGFP同时表达。取其中1株荧光单克隆细胞饥饿培养，进行绵羊的体细胞核移植，结果显示:对146个卵母细胞进行核移植，得到45个8细胞期胚胎，其中14个发育到囊胚阶段，激光共聚焦显微镜下观察囊胚中的每个细胞均发出绿色荧光，并检测到囊胚中有ALR蛋白的表达。由此说明EGFP、ALR在细胞和胚胎水平上同时表达。建立了一套胚胎移植前高效的体细胞核移植筛选系统。 6.原核显微注射法制备转基因绵羊胚胎 本研究利用原核显微注射法将线性化的pGEM一BAE DNA注射于182枚绵羊受精卵原核中，体外发育培养48hr，荧光显微镜下观察，可见5枚荧光胚胎，表明所构建载体中 EGFP能够作为标记基因进行转基因阳性胚胎筛选，为进一步生产乳腺特异性表达ALR的转基因
章波, 王清明, 陈惠鹏[3]2001年在《肝再生增强因子研究进展》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子是新近克隆的蛋白质因子 ,能特异地刺激肝源细胞的增殖 ,并对CCl4 所引起的急性肝衰竭有救治作用。本文综述了肝再生增强因子的发现、基因克隆及组织分布等。目前已开始了该因子的基因工程产品研制 ,它有望成为一种治疗肝病的新药
邓建川[4]2006年在《人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究》文中认为目的:肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)是近年来发现的一种促肝细胞再生的细胞因子。ALR的生物学作用主要表现在直接刺激肝细胞增殖和再生、对肝脏的保护作用、参与组织器官的形成与发育、免疫调控作用以及促肝癌细胞增殖等效应。尽管有上述重要生物学作用,但ALR究竟如何发挥生物学作用目前仍知之较少。如果能获得与ALR发生相互作用的蛋白,并且鉴定出ALR受体,将有助于深刻理解ALR的生物学功能,特别是为深入了解ALR与肝癌发生、发展的关系奠定基础。本实验拟从人肝癌细胞的cDNA噬菌体表面展示文库中筛选与人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration, hALR)相互作用的特异噬菌体克隆,通过序列分析及生物学活性检测确认hALR相互作用蛋白,构建原核表达载体,为进一步鉴定ALR受体提供实验基础。方法:1.以hALR为靶蛋白,从人肝癌细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与hALR相互作用的特异噬菌体克隆;对获得的特异噬菌体克隆cDNA插入片段进行序列测序及生物信息学分析;利用3H-TdR掺入法测定hALR联合阳性噬菌体展示肽及单独阳性噬菌体展示肽对QGY肝癌细胞株的增殖效应。
李丹丹[5]2005年在《hALR相互作用蛋白的筛选与鉴定》文中研究表明肝脏再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是肝脏再生过程中的一个重要调控因子。人ALR(hALR)是分子量为15 Ku的蛋白质分子,由125个氨基酸残基组成,在非变性条件下以同源二聚体的方式存在,具有较强的耐热性,70℃、30min不变性、不失活。肝再生研究发现ALR能增强肝细胞扩增,阻止粗面内质网、线粒体和其它细胞器的损坏,抑制淋巴细胞扩增,对肝脏再生及肝脏功能的修复有着重要作用。动物实验表明ALR对急性肝功能损伤有明显疗效。然而ALR的作用机理尚未完全明确,寻找与ALR相互作用的蛋白质将有助于进一步阐明其作用机制。 本课题以hALR的编码序列为诱饵,采用细菌双杂交系统对人肝cDNA文库中可能与ALR相互作用的蛋白质进行了筛选,结果共得到32个阳性克隆,经过序列测定证明分别为编码人氨基乙酸-N-乙酰转移酶、集落刺激因子、凝血素(hemopexin)、补体C3、α-酸性糖蛋白2、纤维蛋白溶酶原、色素上皮细胞来源因子SERPIN F1、白蛋白、线粒体QD8159、线粒体单倍体As8D、染色体11qCMB9-78H16克隆、cDNA克隆IMAGE:3535684等的基因。经过文献调研和归类分析,选取可能与hALR功能最相关的氨基乙酸-N-乙酰转移酶(glycine-N-acyltransferase,GAT)进行了进一步的克隆、表达和相互作用研究。 GAT是成年动物肝细胞核基因编码的一种线粒体蛋白,为单体分子,有两种不同的亚型。其中a亚型由296个氨基酸残基组成,为线性分子,分子量约为30Ku,pI为6.8:b亚型由163个氨基酸残基组成,是分子量约18.5Ku的线性分子。b亚型的3’编码区以及3’UTR区与a亚型有所区别,因此b亚型的转录本较小,其C-端的氨基酸序列与a亚型不一样。稳定性研究显示,GAT在100mmol/LNaCl、KCl和K3PO4溶液条件下,其酶活性分别为47%、21%和32%。GAT在4℃ 72h、25℃ 4h以及37℃ 1h其酶活性均无改变。GAT具有多种脂酰辅酶A的活性,在线粒体中催化氨基乙酸与乙酰辅酶A底物发生反应,在内
杜喆[6]2006年在《ALR-EGFP真核表达载体的构建、在大鼠体内的表达及其抗肝损伤作用的实验研究》文中研究指明目的：肝再生增强因子(ALR)是从新生大鼠肝组织中克隆到的一种肝增殖刺激因子，能特异地刺激肝细胞增殖，是肝再生的重要调控因子，能提高中毒性肝损伤动物的存活率，在肝损伤修复过程中发挥作用。本研究拟构建ALR与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核细胞表达载体，将GFP基因作为标记基因，以基因治疗的方式，观察ALR基因给予CCl_4诱导的肝损伤大鼠后，绿色荧光蛋白在肝组织和其它组织内的表达情况，肝组织病理及肝损伤的恢复情况等，探讨ALR基因对急性肝损伤的保护作用，以期为ALR临床救治急性肝病提供理论依据和新的治疗方法。 方法：以本室保存的质粒pBV-220-ALR为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30sec，50℃退火20sec，72℃延伸10sec，30个循环结束后72℃延伸10min，PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，并经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切后，与相同酶切的真核高效表达载体pEGFP-C2进行体外定向重组，连接产物转化感受态E.coli DH5α。于含卡那霉素的LB培养基筛选重组子，对阳性重组子进行酶切鉴定和测序。测序使用Sanger双脱氧末端中止法。鉴定正确后，进行重组质粒的大量抽提并纯化，紫外分光光度计测OD_(260)定量。取大鼠48只，按2ml／kg腹腔注射50％CCl_4(1体积CCl_4：1体积豆油)，进行肝损伤模型
赵春丽[7]2003年在《人肝再生增强因子基因的克隆、真核表达载体构建及原核表达》文中认为人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration，hALR)是一种新的细胞因子，能特异性地刺激肝源细胞的增殖，并对四氯化碳、半乳糖胺等肝毒剂引起的肝损伤有治疗作用。本课题选用hALR作为研究对象，重点研究其分子克隆、真核表达载体构建及原核表达。 本实验从6月龄人胎肝中提取总RNA，利用两步法RT-PCR技术扩增hALR基因片段。将hALR基因克隆到原核融合表达载体PET28a(+)上，序列分析后亚克隆到真核表达载体pcDAN3.1(+)上。将原核表达载体的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导物进行诱导表达，探索最佳诱导时间和诱导物的使用浓度。利用Western-blot和Scion Image 4.02 Beta生物学图像分析软件对表达蛋白进行定性和定量分析。 本实验成功地克隆出431bp的hALR基因片段，经序列分析表明，与Genebank中发表的hALR序列相比有3个位点(第36、177、312位)的碱基不同，同源性达99.4％。并完成了真核表达载体的构建，为hALR基因的真核表达做好了前期准备。hALR基因原核诱导表达后，Western-blot证实获得了18.7KD的融合蛋白。首次揭示在未诱导的情况下，hALR也有少量表达。对表达蛋白的定量分析得出，当IPTG终浓度为1.0mmol／L，诱导3个小时蛋白表达量最大。
黄志刚, 刘殿武, 张辉, 杨维青, 刘树贤[8]2001年在《大鼠肝再生增强因子的基因克隆》文中提出目的克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从 2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片段亚克隆到pBV2 2 1质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约 4 0 0bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约 15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从 2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达。
张勇[9]2006年在《肝再生增强因子促进肝再生的信号途径研究》文中提出目的：动物实验已证明ALR可促进肝再生，但体外细胞实验对ALR能否直接使肝细胞增殖存在相反的结果。对ALR在促进肝再生过程中和其它肝源性细胞因子的相互关系仍不完全清楚。本研究拟以鼠肝大部切除(PH)动物模型结合体外细胞实验，探讨ALR间接促进肝再生的可能信号途径。 材料与方法：1．肝再生率评价ALR对小鼠肝大部切除(PH)后肝再生的影响；2．MTT检测ALR与肝再生大鼠血清协同对肝细胞增殖、ALR拮抗TGF-β_1抑制肝细胞增殖、Kupffer或Ito细胞条件培养液(KCCM+／ICCM+)对肝细胞增殖以及ALR对Ito细胞增殖的影响；3．免疫组织化学观察肝再生过程中ALR的表达变化、ALR是否结合于KC细胞膜表面、ALR对KC中IL-6和TGF-β_1的表达和对Ito细胞中TGF-α表达以及对经TGF-β_1刺激后Ito细胞中α-SMA表达的影响；4．放免法检测ICCM+中TGF-α的含量；5．免疫细胞化学和Western blot检测ALR对Ito细胞中TGF-β_1表达和外源性ALR对肝细胞中ALR自身表达的影响。 结果：1．ALR可促进小鼠PH后肝再生；且能协同肝再生大鼠血清促进肝细胞增殖；2．ALR主要分布于正常肝细胞胞浆内，大鼠PH后第2d和3d，肝脏中ALR免疫反应阳性信号减弱消失，第6d基本恢复正常：3．ALR能拮抗TGF-β_1抑制肝细胞增殖的作用；4．外源性ALR能使肝细胞中ALR表达的增高；5．KCCM+／ICCM+能明显促进肝细胞增殖；6．KC细胞膜表面可能存在ALR结合位点或受体；7．ALR能增加KC中的IL-6和Ito细胞中的TGF-α的表达而抑制KC和Ito细胞中TGF-β_1的表达；放免测定显示ICCM+中TGF-α含量增高；8．ALR可抑制Ito细胞增殖和降低经TGF-β_1激活后，Ito细胞中α-SMA的表达量。 结论：1．ALR可能以自分泌方式释放，与肝再生相关因子相互影响如：抑制TGF-β_1生物活性，间接促进肝再生；2．ALR可通过直接作用于KC和Ito细胞，使KC中IL-6表达增高，而TGF-β_1表达降低；使Ito细胞中TGF-α表达增高，而TGF-β_1表达降低，间接促进肝再生；3．ALR可能通过抑制Ito细胞增殖和表型转化，以减少细胞外基质(ECM)沉积，加速肝再生。
谢姣[10]2008年在《激活素A及其信号蛋白在小鼠肝切除再生中的表达研究》文中研究表明激活素A(Activin)属于TGF-β超家族的多功能生长分化因子,新的研究表明激活素及其特异结合蛋白——卵泡抑素(Follistatin,FS)可能是肝再生的重要调节因子,但有关激活素及其相关信号传导相关蛋白在肝再生过程中的表达情况,仍缺乏明确报道。本研究采用小鼠肝部分切除模型,通过测定血清转氨酶及肝脏指数反映肝功能;HE染色观察肝组织再生情况;同时采用免疫组织化学染色观察Activin、FS、激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)的表达,实时定量PCR测定肝组织ActRⅡA、ActRⅡB mRNA表达水平。肝切除再生组血清转氨酶水平明显高于对照组,肝脏指数也略高于对照组;HE染色显示,肝切除组肝细胞排列紊乱、细胞增生明显。上述资料表明本研究成功建立了肝部分切除手术模型。定量PCR测定肝切除模型鼠肝组织ActRⅡA、ActRⅡB mRNA表达水平明显高于对照组;免疫组织化学染色显示,肝切除组肝组织Activin A、ActRⅡA蛋白表达均较模拟手术对照组明显增强,但FS蛋白表达无显着变化。上述资料提示,单纯肝切除后Activin A起主要作用,不利于肝早期再生;阻断Activin作用,有可能利于肝细胞再生和肝功能的恢复。
参考文献：
[1]. 人肝再生增强因子基因克隆、表达、生物活性及应用研究[D]. 郝艳秋. 东北农业大学. 2003
[2]. 用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究[D]. 马玉珍. 内蒙古大学. 2004
[3]. 肝再生增强因子研究进展[J]. 章波, 王清明, 陈惠鹏. 生理科学进展. 2001
[4]. 人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究[D]. 邓建川. 重庆医科大学. 2006
[5]. hALR相互作用蛋白的筛选与鉴定[D]. 李丹丹. 第二军医大学. 2005
[6]. ALR-EGFP真核表达载体的构建、在大鼠体内的表达及其抗肝损伤作用的实验研究[D]. 杜喆. 河北医科大学. 2006
[7]. 人肝再生增强因子基因的克隆、真核表达载体构建及原核表达[D]. 赵春丽. 东北农业大学. 2003
[8]. 大鼠肝再生增强因子的基因克隆[J]. 黄志刚, 刘殿武, 张辉, 杨维青, 刘树贤. 河北医科大学学报. 2001
[9]. 肝再生增强因子促进肝再生的信号途径研究[D]. 张勇. 中国人民解放军军事医学科学院. 2006
[10]. 激活素A及其信号蛋白在小鼠肝切除再生中的表达研究[D]. 谢姣. 吉林大学. 2008
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