高效生物转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的过程优化

论文摘要

苯乳酸（Phenyllactic acid,PLA）是一种安全无毒且天然的新型广谱抗菌物质,可以被应用于医药、食品、化妆品和农作物等行业。本文以重组大肠杆菌BL21（DE3）-pRSF-aad-ldh10-fdh为研究对象,旨在降低发酵培养基的成本和提高3 L发酵罐水平上苯乳酸合成产量。在摇瓶水平上优化发酵培养基的碳源氮源浓度和种类,结合菌体密度和发酵成本选择最佳单因素;在3 L发酵罐水平优化菌体培养条件,考察搅拌转速和通气量对培养体系溶氧值（DO）及菌体密度的影响,为分批补料培养奠定基础;在3 L发酵罐水平优化菌体共表达酶的诱导条件,通过考察全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯乳酸的能力,确定了诱导剂浓度、诱导时机和诱导温度。在全细胞转化过程中,添加适量葡萄糖能显著提高转化效率,本文还探讨了葡萄糖在提高苯乳酸转化效率的机理。具体研究结果如下:（1）摇瓶水平上最适发酵培养基组成及培养条件为:葡萄糖4 g/L、FM802安琪酵母浸粉24 g/L、KH2PO4 2.3 g/L、K2HPO4 12.5 g/L,初始pH 7.0,250 mL摇瓶装液量为25 mL,接种量4%,在37°C下,220 r/min培养14 h。（2）在3 L发酵罐上,采用上述培养基,优化了发酵条件（搅拌转速和通气量）和补料分批策略（恒速流加、pH-stat和DO-stat）。在搅拌转速为400 r/min,通空气量为1.5 vvm,采用恒速补料策略,发酵培养3 h开始将400 g/L葡萄糖以10 mL/h恒速补料10 h,在此条件下细胞干重达到13.71 g/L。（3）在3 L发酵罐上对诱导剂浓度、诱导时机和诱导温度进行优化,确定最佳诱导剂浓度为0.08 mmol/L,诱导时机为培养2 h之后,诱导温度为25℃。（4）在3 L发酵罐上优化全细胞转化条件:NADH再生、底物浓度、转化温度、pH、搅拌转速和通气量,结果表明,以葡萄糖作为辅酶NADH再生来源,当细胞干重为30 g/L、转化温度为37℃、pH 7.0、300 r/min和通空气量1.0 vvm时,在3 L发酵罐中生物转化30 g/L底物L-苯丙氨酸合成苯乳酸,产量为25.4 g/L,转化率达84.7%。（5）从胞内ATP水平的变化、细胞干重的变化、从葡萄糖合成苯乳酸的情况以及细胞膜完整性分析葡萄糖在提高苯乳酸转化效率的机理,研究结果表明,在全细胞转化过程中添加葡萄糖可有助于提高细胞中ATP的水平,缓解苯乳酸导致的细胞活力下降及ATP减少,维持细胞在转化过程中的活性;在全细胞转化过程前后,添加葡萄糖对细胞干重和细胞膜的影响不明显;重组大肠杆菌BL21（DE3）-pRSF-aad-ldh10-fdh可以利用葡萄糖直接合成苯乳酸,转化率最高为0.433%。

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摘要

Abstract

1 绪论

1.1 苯乳酸的概述

1.1.1 苯乳酸的抑菌作用

1.1.2 苯乳酸的应用

1.2 苯乳酸的制备

1.2.1 化学法

1.2.2 生物法

1.3 大肠杆菌工程菌的培养

1.3.1 培养条件

1.3.2 分批补料培养策略

1.4 立题背景和意义

1.5 课题主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 仪器

2.1.3 菌株与质粒

2.1.4 培养基

2.2 菌株培养

2.2.1 菌种活化

2.2.2 种子液培养

2.2.3 发酵罐培养

2.3 实验方法

2.3.1 发酵培养基的优化

2.3.2 3L发酵罐控氧方式的优化

2.3.3 分批补料培养策略

2.3.4 诱导条件的优化

2.3.5 全细胞催化条件优化

2.4 分析检测方法

2.4.1 细胞干重

2.4.2 残糖测定

2.4.3 HPLC分析L-Phe、PPA和 PLA

2.4.4 LC-MS鉴定苯乳酸

2.4.5 冷场发射扫描电镜

2.4.6 胞内ATP含量分析

2.5 数据处理

3 结果与讨论

3.1 发酵培养基碳源及氮源的选择和优化

3.2 3L发酵罐中重组大肠杆菌培养条件的优化

3.2.1 溶氧对菌体密度的影响

3.2.2 分批补料策略对菌体生长的影响

3.3 诱导条件对菌体生长和苯乳酸转化率的影响

3.3.1 诱导剂浓度对苯乳酸转化率的影响

3.3.2 诱导时机对苯乳酸转化率的影响

3.3.3 诱导温度对苯乳酸转化率的影响

3.4 全细胞催化苯丙氨酸合成苯乳酸的条件优化

3.4.1 辅酶供给来源对苯乳酸产量的影响

3.4.2 底物浓度对苯乳酸产量的影响

3.4.3 温度对苯乳酸产量的影响

3.4.4 pH对苯乳酸产量的影响

3.4.5 转速对苯乳酸产量的影响

3.4.6 通气量对苯乳酸产量的影响

3.5 外源添加葡萄糖对全细胞催化过程的影响

3.5.1 对细胞干重的影响

3.5.2 从头（葡萄糖）合成苯乳酸

3.5.3 细胞膜完整性

3.5.4 胞内ATP水平

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录 Ⅰ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘周玭

导师: 王淼

关键词: 苯丙氨酸,苯乳酸,培养基优化,诱导条件,分批补料策略,全细胞转化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ921

总页数: 52

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