自噬基因ATG13在人类红系发育过程中的功能研究

论文摘要

目的:红系发育是一个复杂且精细的发育过程,正常的红系发育包括早期祖细胞分化、红系终末分化和网织红细胞成熟三个阶段。自噬是一种依附于溶酶体对细胞内大分子物质、细胞器等物质进行降解的生理过程,在红系终末分化后期核糖体、线粒体等细胞器的清除中发挥重要作用。其中自噬起始复合物由ATG13、ULK1、FIP200、ATG101组成,ATG13起到连接ULK1与FIP200及增强ULK1激酶活性的作用。查阅相关文献发现,ULK1基因在红系发育过程的网织红细胞成熟阶段细胞器的消失中扮演重要的角色,比如:线粒体和核糖体的清除;FIP200基因对小鼠胚胎造血干细胞的细胞自主性维持有重要作用;而ATG13和ATG101基因在红系中还没有研究。由此猜测组成自噬起始复合物的ATG13、ULK1、FIP200及ATG101在红系发育过程中发挥不同的作用,且存在功能差异。为研究自噬起始复合物在红系发育中的功能差异,本课题采用shRNA干扰基因表达的方法,在K562细胞中分别敲低ATG13、ULK1、FIP200及ATG101基因,从mRNA水平检测其敲低效率,通过氯化高铁血红素（Hemin）诱导敲低的K562细胞向红系分化,检测细胞增殖、凋亡、分化的变化情况;之后在脐带血来源的CD34+细胞中敲低ATG13基因并在不同的培养体系中向红系分化,检测细胞增殖、分化、凋亡、脱核等表型的变化情况。通过敲低ATG13、ULK1、FIP200及ATG101,研究其对红系发育过程的不同影响,进而研究自噬起始复合物的功能差异以及ATG13基因独特的功能。方法:为了研究ATG13、ULK1、FIP200及ATG101在红系发育中的功能,首先查找了K562细胞中四个基因的表达情况以及脐带血来源的CD34+细胞RNA-seq结果中四个基因在各期的表达情况。其次在K562细胞中分别敲低ATG13、ULK1、FIP200及ATG101,然后用hemin分别诱导ATG13、ULK1、FIP200及ATG101敲低的K562细胞向红系分化,在诱导后的四天中分别对细胞计数绘制生长曲线、联苯胺染色检测细胞分化、AnnexinV/7AAD染色检测细胞凋亡。构建PRRL-EGFP-LC3B质粒并包装病毒转染到ATG13敲低的K562细胞中,在加入自噬抑制剂BafA1的情况下,用共聚焦显微镜观察其绿色荧光点状聚集情况,以检测自噬水平。最后诱导慢病毒转染敲低ATG13表达的脐带血CD34+细胞向红系分化,通过quantitative real-time PCR以及western blot检测ATG13的敲低效率,用流式细胞仪检测红系分化过程、细胞凋亡情况及脱核效率情况,用血球计数板对细胞计数并绘制生长曲线,细胞甩片后用MGG染色观察细胞形态。通过quantitative real-time PCR在ATG13敲低的CD34+细胞中检测凋亡基因的变化情况,以此探究敲低ATG13引起细胞凋亡的原因。结果:在K562细胞中ATG13、ULK1、FIP200及ATG101均有表达,且存在差异;RNA-seq结果显示ATG13、ULK1、FIP200及ATG101随着红系分化表达逐渐增高,在中幼红细胞和晚幼红细胞阶段表达比较高。在K562细胞中敲低ULK1,对细胞的增殖、分化、凋亡都没有影响;敲低FIP200,细胞的增殖、分化没有变化,细胞凋亡在第一天和第二天差异显著但不明显;敲低ATG101,细胞的增殖、凋亡不受影响,分化在第一天到第三天实验组比对照组快,但在第四天时分化趋于一致;敲低ATG13,细胞增殖变慢,凋亡增加,分化延迟。由于在K562细胞中敲低ATG13表型很明显,故进一步检测了敲低ATG13后细胞自噬的变化情况。即在敲低ATG13的K562细胞中同时转入EGFP-LC3B融合蛋白,用共聚焦显微镜观察到对照组和实验组的绿色点状聚集没有明显差异,但加入自噬抑制剂BafA1后可以明显看到ATG13敲低组的自噬受阻。在CD34+细胞中敲低ATG13,发现细胞增殖从第13天开始减少,同时细胞凋亡从第13天增加;细胞分化略有延迟,但不阻滞;细胞脱核率降低;在第7天、第13天、第15天取细胞检测P53、Cytc、Bax、Bak、Smac、Bcl-2、cIAP1、cIAP2、AIF、PARP1、TNF、BNIP3凋亡基因的表达情况,发现敲低ATG13凋亡基因P53、Cytc、Bax、Bak、Smac表达逐渐升高;Bcl-2、cIAP1、cIAP2、AIF表达逐渐降低;PARP1、TNF、BNIP3的表达不变。结论:在红系发育过程中,ATG13具有与其他三个自噬起始复合物基因ULK1、FIP200、ATG101不同的功能,ATG13可以通过影响P53、Cytc、Bax、Bak、Smac的表达调控细胞凋亡,说明ATG13可能在红系发育中发挥着不依赖于自噬的特殊功能。

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摘要

Abstract

中英文缩略词表

第1章前言

1.1 红系发育

1.2 自噬

1.2.1 自噬的种类

1.2.2 自噬的发生过程

1.3 自噬起始复合物

1.3.1 ATG13基因

1.3.2 ULK1基因

1.3.3 FIP200基因

1.3.4 ATG101基因

1.4 研究目的和意义

第2章 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101分别敲低后对K562细胞向红系分化的影响

2.1 实验仪器与材料

2.1.1 实验主要用到的仪器

2.1.2 实验用到的细胞株及质粒

2.1.3 实验试剂

2.1.4 实验相关试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101敲低型表达载体的构建

2.2.1.1 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101基因的siRNA序列

2.2.1.2 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101基因的shRNA序列

2.2.1.3 PLKO载体信息

2.2.1.4 得到ATG13、ULK1、FIP200、ATG101敲低的PLKO载体

2.2.2 构建PRRL-EGFP-LC3B载体

2.2.2.1 PCR仪扩增EGFP和LC3B及连接EGFP和LC3B

2.2.2.2 PRRL载体信息

2.2.2.3 得到PRRL-EGFP-LC3B绿色荧光载体

2.2.3 慢病毒包装

2.2.4 病毒转染K562细胞及药物筛选

2.2.5 检测ATG13、ULK1、FIP200、ATG101在K562细胞中的敲低效率

2.2.5.1 实时荧光定量PCR的基因引物序列

2.2.5.2 敲低K562细胞后提取RNA

2.2.5.3 反转录

2.2.5.4 实时荧光定量PCR

2.2.6 检测ATG13在K562细胞中的蛋白表达水平

2.2.6.1 蛋白质的制备

2.2.6.2 Western blot

2.2.7 Hemin处理K562细胞定向红系分化

2.2.8 细胞增殖的检测

2.2.9 联苯胺染色法检测细胞分化

2.2.10 检测细胞凋亡

2.3 结果与分析

2.3.1 PLKO-sh RNA载体的构建

2.3.2 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101基因在K562细胞中的表达情况

2.3.3 ULK1基因在K562细胞中的敲低后的表型

2.3.4 FIP200基因在K562细胞中的敲低后的表型

2.3.5 ATG101基因在K562细胞中的敲低后的表型

2.3.6 ATG13基因在K562细胞中的敲低后的表型

2.3.7 ATG13在K562细胞中的敲低后自噬受阻

2.3.7.1 PRRL-EGFP-LC3B载体的构建

2.3.7.2 转染PRRL-EGFP-LC3B到ATG13敲低的K562细胞

2.4 实验小结

+细胞向红系发育的影响'>第3章 ATG13基因敲低对CD34⁺细胞向红系发育的影响

3.1 实验仪器与材料

3.1.1 主要用到的材料与试剂

3.1.2 实验主要用的仪器

3.1.3 脐带血来源

3.1.4 主要试剂的配制

3.2 实验方法

+细胞的方法'> 3.2.1 脐带血中分离CD34⁺细胞的方法

+细胞的培养过程'> 3.2.2 CD34⁺细胞的培养过程

3.2.3 红系早期分化的检测

3.2.4 红系终末分化的检测

3.2.5 细胞脱核的检测

3.2.6 MGG染色

3.3 结果与分析

+细胞各阶段的表达情况'> 3.3.1 ATG13、ULK1、FIP200、ATG101在CD34⁺细胞各阶段的表达情况

+细胞中的敲低效率'> 3.3.2 ATG13基因在CD34⁺细胞中的敲低效率

+细胞的增殖有抑制作用'> 3.3.3 ATG13基因敲低对CD34⁺细胞的增殖有抑制作用

3.3.4 ATG13敲低促进人类红系分化过程中的凋亡增加

+细胞的早期分化有抑制作用'> 3.3.5 ATG13基因敲低对CD34⁺细胞的早期分化有抑制作用

3.3.6 ATG13敲低使人类红系终末分化略微延迟

+细胞脱核减少'> 3.3.7 ATG13敲低使CD34⁺细胞脱核减少

3.3.8 ATG13敲低后对红细胞形态变化的影响

+细胞中敲低ATG13后凋亡基因mRNA表达水平的变化'> 3.3.9 在CD34⁺细胞中敲低ATG13后凋亡基因mRNA表达水平的变化

3.4 实验小结

第4章全文讨论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张阳阳

导师: 安秀丽

关键词: 自噬起始复合物,细胞凋亡,红系发育

来源: 郑州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 郑州大学

分类号: Q23

总页数: 89

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