王海宾[1]2003年在《多聚羟基烷酸的代谢调控与基因工程菌的构建》文中提出多聚羟基烷酸是一类由生物合成的结构简单的高分子聚合物，它不仅具有石化塑料的特性，而且具有生物可降解性、生物相容性、降解产物无毒性的特性，是一种环境友好型的生物材料。这种新材料对于解决白色污染的环境问题以及医学组织工程框架材料有着重要的应用价值。我们在研究费氏中华根瘤菌(S.fredii)合成多聚羟基丁酸(PHB)的基础上，在以烷酸盐作为调节剂，进行了代谢调控，获得了羟基丁酸和羟基己酸共聚体[P(HB-HH)]和羟基丁酸和羟基辛酸共聚体[P(HB-HO)]两种新型的多聚羟基烷酸(PHAs)，其中P(HB-H0)填补了PHAs系列生物材料的空白。并且研究了代谢控制发酵的相关参数，初步制定出生产这两种产品的生产工艺。根据费氏中华根瘤菌在以葡萄糖为碳源时合成PHB，而在烷酸盐提供一定环境胁迫压条件下，改变了代谢方向，我们推导出该菌合成PHAs的代谢途径。根据P(HB-co-HH)P(HB-co-HO)的理化及生物学性质，这两种新型生物材料在医学组织工程有着良好的应用前景。此外，我们采用分子生物学技术，以携带orfZ基因(4-羟基丁酰辅酶A转移酶)的转座载体pTn5cat的E.coli为供体菌，以S.fredii为受体菌，构建合成3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚体的基因工程菌。该菌通过代谢调控有可能合成全新的PHAs叁聚体，开发一类新型的生物材料。
张晗星[2]2006年在《聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究》文中提出聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHA)是很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在。由于具有诸如生物可降解性、生物相容性、光学性、压电性、气体相隔性等许多优良性能，而可以应用在众多领域。作为一类难以降解石油烃制品的替代品，PHA可以减轻对土壤和水体的污染，因而被广泛关注并应用。PHA这些年的研究重点在于中长链聚羟基脂肪酸酯(PHA_(MCL))作为特殊的生物高分子材料的开发，由于聚酯的结构可以进行调整，因此高分子的性能就可以很容易的调控以适合特定的要求。这些特殊产品的附加值非常高，因此在生物医药方面的应用前景诱人。 本论文从32株油田分离的菌株，筛选得到高产PHA、PHB的菌株各一株。首次报道了交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)深海适冷菌SM9913，胞内合成PHA；并对生理生化性质及发酵培养条件进行了研究。在其中一株铜绿假单胞菌中，克隆得到phaJ，phaC基因，构建了包括两个脂肪酸代谢相关基因的PHA表达载体。旨在应用基因工程的方法，将外源的PHA合成相关基因在大肠杆菌工程菌株中进行表达，构建了一条新的PHA合成加强型的代谢通路，使受体菌获得高效产生PHA的能力。同时对PHA在细菌体内合成机制，引发机制及对其新陈代谢的调控机制进行研究。阐述了fadD基因在脂肪酸氧化途径中对FadR因子解阻遏作用，揭示了中链脂肪酸被利用的机理；并提出了在大肠杆菌重组菌PHA合成过程中对脂肪酸脱毒作用的概念；从而为合成新型PHA提供理论依据和技术帮助；为最终将产PHA的工程菌应用到医药行业等领域做准备。
冯涛[3]2005年在《多聚羟基烷酸异聚体的代谢调控及其下游加工过程研究》文中进行了进一步梳理多聚羟基烷酸(PHA)是一类由生物合成的结构简单的高分子聚合物,它不仅具有石化塑料的特性,而且具有生物可降解性、生物相容性、降解产物无毒性的特性,是一种环境友好型的生物材料。这种新材料对于解决白色污染的环境问题以及医学组织工程框架材料有着重要的应用价值。 本论文研究了费氏中华根瘤菌S. fredii以葡萄糖为主要碳源,月桂酸和癸酸作为辅助碳源,通过代谢调控,分别获得了3-羟基丁酸和3-羟基辛酸共聚体P(HB-HO),3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚体P(HB-HH),并且分别研究了两种产品的高密度发酵调控实验的相关参数。其中聚合物P(HB-HO)填补了PHA系列生物材料的空白。实验结果表明:(1)P(HB-HO)中HO和P(HB-HH)中HH组分含量与月桂酸的加入时间和浓度有密切的关系,烷酸盐的最佳加入时间为胞内多聚物合成初期,即细胞生长期后期;尽管高浓度烷酸盐下可获得较高的HO、HH组分含量,但会明显抑制菌体的生长和产物的合成;通过控制烷酸盐浓度可以得到不同HO、HH组分含量的共聚体。(2)分别进行了P(HB-HO)和P(HB-HH)100L大罐发酵试验,在合成阶段,采用两阶段发酵方式和两步加盐法,不仅避免了高浓度烷酸盐对菌体的抑制作用,而且控制了冒顶现象。P(HB-HO)占干细胞最大为38.7%,单体比例为HO:HB=1:3.9,粘均分子量为1.51×105Da,P(HB-HH)总含量占干细胞30%,单体比例为HH:HB=1:1.6,粘均分子量1.37×10~5Da。 另外,分别进行了溶剂萃取法和水相分离法的两种方法提取PHA,通过正交数据分析设计实验,结果表明:使用氯仿-乙醇法提取2h-4h的效果最佳,收率可达到95.11%,纯度可达99.4%;而水相分离法中,硫酸法提纯产品纯度很低;碱法提取过程中,对产品的降解十分强烈;超声波法虽对细胞壁有一定的破碎作用,但是无法分离出与细胞残片混在一起的PHA颗粒。 接着我们对氯仿-乙醇萃取条件及不同萃取方式进行了研究,结果表明:(1)综合分析得出:萃取温度为40℃,氯仿与干细胞混合比例为5:1(v/g),处理2～4小时,萃取液浓缩到1/10体积,沉淀剂乙醇加量
黄海东, 赵良启[4]2002年在《新型生物可降解塑料——多聚羟基烷酸研究进展》文中研究指明面对日益严重的白色污染 ,人们迫切需要一种能在自然界较快分解的新型塑料。多聚羟基烷酸是原核生物在不平衡代谢条件下形成的碳源和能源贮藏物质 ,这种贮藏物质如同淀粉、糖原一样 ,当生命活动需要时可以再分解利用。由于多聚羟基烷酸有着与石化塑料相似的理化性质 ,
唐雪玲[5]2003年在《提高G-Ⅲy菌株PHB产量及其性能改善的研究》文中研究说明对一株产PHA菌株——G-Ⅲy的发酵条件进行了优化试验，确定了分批补料发酵的最佳条件为：初始蔗糖浓度为2.1％，(NH_4)_2SO_4浓度0.07％，柠檬酸铁铵浓度0.006％，发酵中控制糖浓度在1.5～2.0％，20小时左右停止流加氮源，可获得较好的生物量，发酵40小时，菌体量可达32.7g·L~(-1)，PHB产率为21.4g·L~(-1)。 研究了添加不同前体物，G-Ⅲy菌株生产聚β-羟基丁酸和聚β-羟基戊酸共聚物(PHBV)的发酵条件，结果表明，此菌株能以丙酸或戊酸为前体，在蔗糖为碳源的条件下合成PHBV共聚物；在2L发酵罐中，以丙酸为前体，发酵16小时开始流加丙酸，根据发酵液pH值变化控制丙酸流加量，发酵42小时，细胞干重、PHBV产量和含量分别达到35.8g/L，22.6g/L，63.13％。经气相色谱、核磁共振分析，此共聚物为3HB与3HV所组成的不规则共聚物，HV组分在共聚物中约占38％；经热分析，获得的PHBV共聚物的熔点有所降低，分解温度有所升高，在性能上优于PHB。 在上述研究的基础上，进行了10L发酵罐的补料放大试验，最终细胞量达37.7g·L~(-1)，PHBV达23.27g·L~(-1)。对G-Ⅲy菌工业化生产PHBV具有实际意义。
王静[6]2001年在《圆褐固氮菌G-3菌株合成3-羟基丁酸3-羟基戊酸共聚物发酵条件研究》文中指出本论文研究了圆褐固氮菌G- 3菌株以蔗糖为主要碳源、戊酸为辅助碳源发酵生产完全可降解塑料3一羟基丁酸3一羟基戊酸共聚物（PHBV）。结果表明，蔗糖低浓度（l％－2％）利于菌体生长，较高浓度（3％－4％）利于PHBV的积累，运用补糖技术，维持发酵液蔗糖浓度在 2％左右，能使菌体生物量和 PHBV产量有较大幅度的增长。溶氧情况对菌体的生长和 PHBV的积累有重要影响，采用前期供氧充分、后期限氧的控制方法可促进PHBV的积累。PHBV中HV组分含量与戊酸的加入时间和浓度有密切的关系，戊酸的最佳加入时间为胞内多聚物合成初期；尽管高浓度戊酸下可获得较高的HV组分含量，但会明显抑制菌体的生长和产物的合成；通过控制戊酸浓度可以得到不同HV组分含量的PHBV共聚物。2L小罐中在PHBV合成阶段流加不同糖酸比混合液，发酵44小时左右，细胞干重达 12．7一17.2g/L，PHBV百分含量 68％以上，HV组分含量为 8.7-24.5mol％。 因固氮菌的本身属性，培养后期发酵液粘度过高，使补糖受抑，生物量和PHBV含量再无法提高。为解决这一问题，将固氮菌G－3菌株和巨大芽抱杆菌G．6菌株混合培养技术运用于PHBV的生产。采用淀粉和蔗糖一起做碳源，G-6菌株恰能利用淀粉水解产生的大量还原糖，使淀粉这种本不适于G－3菌株生长和产物积累的廉价碳源得以使用，进一步降低了生产成本。增加补料量，总糖量12O、戊酸0．5o，菌体生物量可达36．3眯，P皿V百分含量达77O，HV组分含量15mol％，是G-3 菌株单独养时的二倍多，取得了好的结果。 研究还对获得的小试样品的理化性质及加工性能进行了测定，证明所得PHBV产品比PHB韧性增强、脆性降低，熔点、热熔、结晶度降低，易于控制熔点加工温度，具有更优越的性质，并且完全符合国际上PHA的各项技术性能指标。
季爱云[7]2010年在《聚β-羟基丁酸酯高产菌株的选育及发酵和提取工艺研究》文中进行了进一步梳理聚β-羟基丁酸酯(PHB)是微生物在营养失衡的条件下贮存的内源性高分子聚合物,除具有与化学合成塑料相似的性质外,还具有生物相容性和生物可降解性,故可作为生物可降解塑料的原料。在“白色污染”日益严重的今天,由微生物发酵法生产PHB成为国内外研究的热点。通过尼罗蓝平板荧光法,结合苏丹黑染色法,从污水中初筛到PHB产生菌。摇瓶发酵复筛,13号菌产PHB能力较强,PHB产量为0.57g/L,将其作为进一步研究的出发菌株。对13号菌株的细胞形态、培养特征、生理生化特征以及对各种碳源和氮源的利用情况进行了研究,根据《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定菌株为动胶菌属(Zoogloea itzigohn),将其命名为Z-13。对Z-13进行紫外诱变育种：紫外灯功率12W,垂直照射距离10cm,照射时间110s。在产PHB能力显着提高的突变菌中,14号菌遗传稳定性最佳,命名为uZ-14。uZ-14的PHB产量为0.78g/L,比诱变前提高了36.84%,将其作为发酵条件研究的菌株。对uZ-14产PHB发酵培养条件优化结果表明,最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为硫酸铵。最佳发酵培养基(g/L)：葡萄糖10,MgSO4·7H2O 0.2, K2HPO4 1.5, Na2HPO4·12H2O 1.8, (NH4)2SO4 0.2, CaCl2·2H2O 0.01,微量元素溶液1ml。最佳发酵条件为：装液量30ml/250ml叁角瓶,pH7.2,30℃,接种量3%,15Or/min振荡培养48h,PHB产量达到1.08g/L,比优化前提高38.46%。对发酵后菌体的PHB提取方法进行了研究,SDS/NaClO-氯仿提取PHB效果最佳,菌体干重/SDS溶液(w/v)1%,30℃处理20min(SDS溶液浓度4g/L),离心取沉淀,加入与SDS溶液相同体积的NaClO溶液(活性氯浓度为2.84%,pH为12),30℃处理20min,离心取沉淀,氯仿抽提后PHB含量可达40.25%,分子量为1206205,在获得较高的PHB提取率的同时又避免了PHB的降解。提取所得样品经紫外光谱、红外光谱和气相色谱等手段进行了定性分析,结果表明,经微生物法发酵所得的样品与PHB标准品一致,可作为原料用于生产生物可降解塑料。
王庆[8]2016年在《菌株Pseudomonas koreensis UVCN18的聚-β-羟基丁酸酯聚合酶基因的克隆与表达》文中研究说明PHA(聚羟基脂肪酸酯)是微生物在碳氮比失衡的条件下,在胞内合成的一种聚酯,这种聚酯可以作为碳源和能源在胞内积累。PHB是至今为止PHA家族中研究最多、最彻底的典型成员,具有良好的生物降解性、生物相容性和热加工特性,其分解产物可全部被微生物所利用,对环境不会造成任何污染,在环保、医药、农业、工业和食品等领域具有十分广阔的应用前景。但由于生产PHB菌种产率低、底物转化率低、工艺复杂、成本高以及产品后续应用型产品开发少等,严重制约了PHB的广泛应用和产业化发展。为了降低生产成本,PHB的生产方法成为研究热点,其中利用微生物基因工程法是目前研究的主要方向,利用大肠杆菌作为表达菌株,构建工程菌,不仅利用大肠杆菌具有生长迅速,培养基原料来源广等优点,而且基因工程菌株生产PHB大大提高了产率,显示出巨大的开发潜力。本研究以菌株Pseudomonas koreensis UVCN18基因组DNA为模板,成功克隆了菌株Pseudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。构建出克隆载体pMD18-T-phbC和表达载体pET-28a(+)-phbC,并构建工程菌通过IPTG诱导,表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,菌株Pseudomonas koreensis UVCN18的PHB聚合酶基因phbC实现了异源蛋白表达。本研究的具体内容如下:(1)根据NCBI上已公布的假单胞菌属的phbC基因设计引物。以菌株Pseudomonas koreensis UVCN18基因组DNA为模板,成功克隆了菌株Pseudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。通过生物信息学分析表明,该基因全长为1704bp,通过BlastP序列对比发现,该基因所表达的氨基酸属于PHA聚合酶家族,与菌种Pseudomonas putida(AHG99486)同源性达96%。将获得的基因序列提交到NCBI,得到登录号为KT716020。(2)克隆载体的构建:将所PCR扩增后获得的PHB聚合酶基因目的基因,与pMD18-T载体连接,获得重组质粒pMD18T-phbC,并成功将质粒pMD18T-phbC转入到大肠杆菌JM109中,获得克隆菌株。(3)表达载体的构建:将克隆载体上的PHB聚合酶基因连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建原核基因重组质粒pET-28a(+)-phbC,转化BL21感受态菌株中,通过含有卡那霉素的培养基筛选,获得重组菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC。(4)鉴定表达:重组表达菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC经诱导剂IPTG诱导后,提取粗酶液,通过SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定,结果与PHB聚合酶分子量63KDa理论相符合,证明实现了异源蛋白表达。
李莉莉[9]2004年在《透明颤菌血红蛋白基因和λ噬菌体裂解基因在产聚羟基烷酸重组大肠杆菌中作用的研究》文中进行了进一步梳理由于透明颤菌血红蛋白基因(vhb)在质粒上高拷贝的表达，降低了PHB的产量。故本文将vhb基因插入到E.coliHMS174的染色体上，构建成为vhb基因整合菌HV，并用CO结合实验证实了血红蛋白的表达。在摇瓶中培养，发现在培养前期，HV的生长与无vhb基因的对照菌E.coli HMS174相差不多，到培养后期时，vhb基因整合菌HV才略有生长优势。 将带有phb操纵子和质粒稳定分配基因parDE的质粒pTZ101引入vhb整合菌中，构建成为产PHB的vhb整合菌HV(pTZ101)。摇瓶中培养40小时，OD_(600)和PHB的含量均比无vhb基因的对照菌E.coli HMS174(pTZ101)高。5-L发酵罐发酵HV(pTZ101)，OD_(600)为50，PHB占干重的47.3％；发酵E.coli HMS174(pTZ101)，OD_(600)为172，PHB占干重的62.4％。 利用PCR扩增得到噬菌体裂解基因的启动子和结构基因(SRRz)，连接在转座子miniTn5上，构建成为质粒MVPS，用于将vhb基因和SRRz基因共同插入到E.coli HMS174的染色体上。对E.coliCC118／λpir(MVPS)进行裂解实验，但是没有成功。
冯美卿[10]2004年在《Pichia pastoris表达重组人载脂蛋白ApoAI和D-氨基酸氧化酶的研究》文中指出本论文包括两部分内容,第一部分为Pichia pastoris 表达重组人载脂蛋白A-I的研究;第二部分为Pichia pastoris 表达D-氨基酸氧化酶的研究。第一部分人载脂蛋白是血浆中重要的脂蛋白,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(Apolipoprotein A, ApoAⅠ)。目前ApoAⅠ主要从人血浆获得,从人血浆提取ApoAⅠ步骤多、成本高,很难实现靶向药物的产业化,且由于血液易受污染使人们不愿接受人血制品。为了大量制备该蛋白,人们尝试利用基因工程系统表达ApoAⅠ,但均不理想。生命科学院宋大新教授首先尝试利用Pichia pastoris表达系统表达ApoAⅠ。其根据Gene Bank ApoAⅠ基因序列设计引物,以含天然ApoAⅠ基因的质粒DNA为模板,通过PCR获得编码天然人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段,将其插入到 P.pastoris分泌型载体PIC9K上,电转化P.pastoris GS115感受态细胞,将获得的1000多个转化子依次在含不同浓度G418的YPD平板筛选高抗性转化子,得到22个可抗4mg/mL G418的高抗性转化子。本研究即在此基础上将22株高抗性菌进行表型鉴定,筛选和比较重组菌表达ApoAⅠ的能力,经摇瓶发酵、SDS-PAGE检测获得高分泌表达重组菌AP16,又经Western blot 鉴定,显示重组菌AP16所表达蛋白为ApoAⅠ。本研究重点对重组菌AP16的培养及诱导表达进行了优化,并在14L发酵罐内实施表达了ApoAⅠ。结果显示:在250ml摇瓶内,接种量为4%,甘油浓度为1%的条件下有利于重组菌的生长,菌体湿重达100mg/mL。诱导过程中,在10×YNB含量为10%、菌体密度OD600为80(约320mg/mL左右)、甲醇含量为1%、pH为7-7.5 的条件下,诱导时间84-96h ApoAⅠ表达量最高,表达水平达180 mg /L。比仓鼠卵巢细胞中表达ApoAⅠ(20mg/L) 高8倍,比钟江教授最新报道的昆虫杆状病毒表达(100mg/L)高80%,<WP=7>是目前国内外基因工程表达ApoAⅠ的最高水平。本研究还首先成功地在14L发酵罐内实现了高密度培养,生长约16h,菌体量(湿重)达150g/L左右,再经诱导60-72h,ApoAⅠ表达量达最高,表达水平达160mg/L。发酵罐内表达ApoAⅠ,操作简便,周期短,整个周期约90h,比摇瓶至少缩短30h。本研究的ApoAⅠ的表达为分泌表达,蛋白纯度高,占可溶性蛋白的70%以上,分离纯化简便,蔡钦生同学经低温丙酮分级沉淀一次性获得纯度高于90%的ApoAⅠ。本论文重组ApoAⅠ成功的分泌表达且表达水平明显高于其它表达系统,再次显示了P.pastoris表达系统的优势,也为ApoAⅠ作为肝脏靶向药物的研究、制备和应用奠定了基础。
参考文献：
[1]. 多聚羟基烷酸的代谢调控与基因工程菌的构建[D]. 王海宾. 山西大学. 2003
[2]. 聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究[D]. 张晗星. 山东大学. 2006
[3]. 多聚羟基烷酸异聚体的代谢调控及其下游加工过程研究[D]. 冯涛. 山西大学. 2005
[4]. 新型生物可降解塑料——多聚羟基烷酸研究进展[J]. 黄海东, 赵良启. 生物技术. 2002
[5]. 提高G-Ⅲy菌株PHB产量及其性能改善的研究[D]. 唐雪玲. 西北大学. 2003
[6]. 圆褐固氮菌G-3菌株合成3-羟基丁酸3-羟基戊酸共聚物发酵条件研究[D]. 王静. 西北大学. 2001
[7]. 聚β-羟基丁酸酯高产菌株的选育及发酵和提取工艺研究[D]. 季爱云. 山东科技大学. 2010
[8]. 菌株Pseudomonas koreensis UVCN18的聚-β-羟基丁酸酯聚合酶基因的克隆与表达[D]. 王庆. 吉林农业大学. 2016
[9]. 透明颤菌血红蛋白基因和λ噬菌体裂解基因在产聚羟基烷酸重组大肠杆菌中作用的研究[D]. 李莉莉. 中国农业大学. 2004
[10]. Pichia pastoris表达重组人载脂蛋白ApoAI和D-氨基酸氧化酶的研究[D]. 冯美卿. 复旦大学. 2004