张凡[1]2004年在《小鼠黑色素移植瘤模型中血管生成拟态形成的时空变化及其分子机制的初步观察》文中研究表明目的：利用小鼠移植瘤模型动态观察血管生成拟态的时空变化以及CD31、MMP2、MMP9、CathepsinD、HMB45在恶性黑色素移植瘤血管生成拟态形成中的作用。 方法：1．建模 采用B16黑色素瘤细胞悬液皮下注射法制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，同时对动物编号。成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12天，获得肿瘤样本114例。2．染色 肿瘤标本常规固定、包埋，HE染色、CD31、CathepsinD、MMP2、MMP9、HMB45免疫组织化学染色和CD31与PAS双重染色。3．计数方法 显微镜下分别计数肿瘤组织中央区和外周区的高倍视野(×400)下血管生成拟态以及内皮依赖性血管，连续计数10个高倍视野，取其均值分别定义为血管生成拟态密度和内皮依赖性血管密度；血管生成拟态周围及远离血管生成拟态区域肿瘤细胞中阳性细胞百分率；内皮依赖性血管周围及远离内皮依赖性血管区域肿瘤细胞中阳性百分率；连续计数10个高倍视野并取其均值。4．图象及数据处理 利用计算机图象处理软件计算每张切片中的坏死面积比；利用SPSS10.0统计软件对数据进行统计分析，以p＜0.05具有统计学意义。结果：在恶性黑色素瘤形成的第1-8天，肿瘤组织内出现图案样PAS染色阳性的管道，其中可见红细胞，同时一部分肿瘤细胞模仿内皮细胞衬复在PAS阳性物质的内表面，形成类似内皮依赖性血管的结构，此即血管生成拟态。该结构在肿瘤中央区和外周区都随时间变化呈现先递增后递减趋势：肿瘤中央区血管生成拟态密度在第1-3天内呈现递增趋势，第4-8天呈现递减趋势；肿瘤外周区血管生成拟态密度在第1-4天呈现递增趋势，在第5-8天呈现递减趋势。两个区域内的血管生成拟态密度比较：在第1-6天内肿瘤中央区高于外周区，在第7-8天肿瘤外周区高于中央区。两个区域内血管生成拟态密度统计学上无明显差别；内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势。比较两个区域内的内皮依赖性血管密度发现：在第1-7天肿瘤中央区内皮依赖性血管密度高于外周区，在第8-12天两个区域内的内皮依赖性血管密 天津医科大学硕士研究生毕业论文度无明显差别。统计学分析显示:两个区域内的内皮依赖性血管密度无明显差别。血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死率之间呈密切负相关 (r二一0.978，P 王巍[2]2010年在《血管生成拟态在喉癌中的临床意义分子机制的初步探讨》文中研究指明目的：喉癌生存率年来无法改变的原因主要是术后无法控制的转移和复发。血管生成拟态是一种新的血供方式,与肿瘤的侵袭性行为和肿瘤相关的死亡有关。本研究旨在探讨血管生成拟态在喉癌侵袭转移过程中的作用。评估其临床病理意义及预后价值。进一步观察血管生成拟态在动物移植瘤模型中表达的时空规律；探讨上皮-间充质转换在喉癌血管生成拟态形成中的可能作用机制。并在此基础上深入探讨EphA2调节的上皮-间充质转换在喉癌血管生成拟态形成中的作用机制。方法：1)回顾性分析203例喉癌患者临床病理资料及随访结果。2) CD31/PAS免疫组化双重染色及CD31染色标记石蜡包埋喉癌组织中血管生成拟态及内皮依赖性血管,比较其在喉癌中的临床病理意义和预后价值。3)进一步用Hep-2细胞建立喉癌动物移植瘤模型,于不同时段处死小鼠,获取肿瘤组织。分别通过CD31/PAS免疫组化双重染色、免疫组织化学染色,real time RT-PCR检测不同时段动物移植瘤组织及人体喉癌标本中血管生成拟态、内皮依赖性血管、EphA2及EMT相关分子的表达。比较其表达的差异。4)小RNA干扰技术在体外降低EphA2在头颈部鳞癌细胞系Hep-2,Tb和CEN-2中的表达。5)体外叁维培养检测Hep-2,Tb和CEN-2细胞管腔结构形成能力变化。6)划痕实验检测Hep-2,Tb和CEN-2细胞迁移能力变化。7) Transwell实验检测Hep-2,Tb和CEN-2细胞侵袭能力改变。8) Western blotting检测Hep-2,Tb和CEN-2细胞上皮-间充质转换相关分子及细胞骨架蛋白表达的改变。结果：1)血管生成拟态是喉癌中不依赖于内皮依赖性血管的一种新的血管生成方式。2)血管生成拟态与喉癌患者的淋巴结转移、TNM分期和组织病理学分级有关(p<0.05)。而内皮依赖性血管与喉癌患者的发病部位、TNM分期、T分级和远处转移有关(p<0.05)。3)单因素分析表明,血管生成拟态、TNM分期、T分级、淋巴结转移、组织病理学分级、肿瘤大小和放疗与喉癌患者总生存期有关。而血管生成拟态、发病部位、肿瘤大小和放疗与与喉癌患者无病生存期有关。多因素分析结果表明血管生成拟态而非内皮依赖性血管,是喉癌患疾病总生存期和无病生存期的独立预后因素。4)血管生成拟态和内皮依赖性血管的密度在喉癌动物移植瘤模型中表达成时间依赖性。血管生成拟态与内皮依赖性血管密度成负相关。5)血管生成拟态、EphA2及EMT相关分子的表达在喉癌动物移植瘤模型中表达成时间依赖性。动物移植瘤模型中不同时段血管生成拟态密度与EphA2, Twist和Vimentin的mRNA表达水平成正相关(r=0.941,0.858,p=0.000,0.000)；与E-cadherin, claudin4和DSG-3的mRNA表达水平成负相关(r=-0.736,-0.769,-0.650；p=0.000,0.000,0.000)。6)人体喉癌标本中免疫组织化学染色和real time RT-PCR表明EphA2, Twist和Vimentin的表达VM+组高于VM-组(p<0.05), E-cadherin, claudin4和DSG-3的表达VM+组低于VM-组(p<0.05)。7)体外敲除EphA2的表达,降低了Hep-2,Tb和CEN-2细胞体外管腔结构形成、肿瘤细胞侵袭迁移能力。8)体外敲除EphA2的表达,使Hep-2,Tb和CEN-2细胞上皮-间充质转换相关分子表达发生逆转,Twist和Vimentin表达水平下降,而E-cadherin, claudin 4和DSG-3表达水平升高。9)体外敲除EphA2的表达,使Hep-2,Tb和CEN-2细胞骨架蛋白Arp2表达水平下降。结论：1)喉癌组织中存在血管生成拟态。2)血管生成拟态阳性的喉癌具有更强的侵袭转移能力,它可能通过促进区域淋巴结转移影响喉癌患者的生存,对预测喉癌患者的转移和生存具有重要价值。3)血管生成拟态在喉癌动物移植瘤模型中表达水平呈时间依赖性,在肿瘤快速生长过程中补充内皮依赖性血管血供不足。4) EphA2及上皮-间充质转换可能参与了喉癌中血管生成拟态的形成。在促进肿瘤细胞侵袭转移能力中起到一定作用。5) EphA2可能通过调节细胞骨架的重排,启动上皮-间充质转换,完成细胞塑形,促进了喉癌血管生成拟态的形成,提高了肿瘤细胞的侵袭转移能力,在喉癌淋巴结转移中发挥重要作用。 梁骁[3]2008年在《多结节性肝细胞癌中血管生成拟态的初步研究及其临床意义》文中研究表明目的探讨血管生成拟态(Vasculogenic Mimicry,VM)在多结节性肝细胞(Hepatocellular Carcinoma,HCC)中的存在及其生物学意义和临床意义,并检测相关蛋白的表达。方法在已对肿瘤细胞的克隆来源进行了鉴别的人多结节性HCC的石蜡标本中,应用特殊组化和免疫组化结合的双重染色技术,寻找VM的存在及其结构形态;并通过免疫组化技术检测金属基质蛋白-2(MMP-2)和血管上皮钙粘附素(VE-cadherin)蛋白的表达。结果1.多结节性HCC中存在VM结构。在36个病例中,有28例(78.7%)存在VM结构;其90个HCC结节中有VM存在的有52个(57.8%)。VM在光镜下表现为由肿瘤细胞围成的无内皮细胞衬附的管道样结构和PAS染色阳性的网络样VM结构。肿瘤细胞和管腔间有一层PAS染色阳性物质间隔或被PAS物质填充。VM结构与相邻CD31阳性的血管相通,也可在其管腔内发现红细胞。多结节性HCC中有无VM的生成与Edmondson病理学分级、是否发生肝内转移、术后复发及术后生存时间的比较有统计学意义(P＜0.05)。即VM在高分化HCC中的发生率低于低分化HCC,有VM生成的HCC较无VM生成的发生肝内转移的几率更高、术后平均复发时间和生存时间更短。2.HCC中与VM生成的相关蛋白表达。MMP-2和VE-cadherin蛋白可促进肿瘤细胞突破基质并重塑结构形成VM。通过对Mattern积分法获得的蛋白表达量进行统计学分析,发现存在VM结构的HCC中MMP-2和VE-cadherin蛋白的表达比无VM结构的HCC更强(P＜0.05)。结论1.多结节性HCC存在较高的VM生成率;2.有VM存在的HCC更容易发生肝内血行转移,并且较无VM的HCC复发率更高、生存期更短、预后更差;3.MMP-2和VE-cadherin蛋白在有VM的HCC中高表达,与VM的生成密切相关;4.在普通病理学检查的基础上进行PAS和CD31双染色以检出VM,是经济、可行的,有利于对其治疗策略的选择和对预后的评估。意义1.本研究立足于多结节性HCC病例,发现与研究对象是单结节HCC为主的研究相比,多结节HCC存在更高的VM生成率。国内外并未见相关报道。2.证实VM这一血管形成的新方式在原发性肝癌复发和转移中所起的作用,对其治疗策略选择和对预后的评估有很高的价值,并为了解原发性肝癌的复发和转移机制提供线索。3.初步探讨了VM生成的相关分子机制,为进一步通过从不同层面和角度的研究,观察阻断肝癌细胞的VM生成对原发性肝癌复发和转移的影响提供了基础。 张丹芳[4]2006年在《黑色素瘤微循环模式及微环境变化对其影响的实验研究》文中指出目的:研究黑色素瘤组织的血管生成拟态、马赛克血管、内皮依赖性血管叁种血液供应模式以及其时空延续关系,在此基础上进一步探索参与肿瘤内皮依赖性血管生成过程中内皮细胞的来源,明确骨髓源性间充质干细胞及循环内皮细胞与肿瘤血管生成的关系。此外本研究还阐述缺血缺氧对黑色素瘤微循环模式的影响,探讨HIF-1α、促血管生成因子VEGF、Epo及肿瘤侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9在此过程中的作用,为临床某些恶性肿瘤的抗血管疗法远期效果不理想提供理论依据。研究不同压力环境中黑色素瘤的微循环模式,探讨组织压力变化对肿瘤血管生成的影响,丰富肿瘤血管生成相关理论。 方法: 1 将B16黑色素瘤细胞悬液接种到60只C57小鼠鼠鼷部,待肿瘤大小达0.5mm左右时,连续处死动物每天5只,持续12天,将瘤组织块制作成组织切片,在切片上进行血管生成拟态、马赛克血管、内皮依赖性血管叁种血液供应模式的计数,初步判定叁种血液供应模式的时间关系趋势,同时利用双重免疫组化染色和电镜技术进行形态学观察。 2 将BrdU标记后的人脐静脉内皮细胞ECV304细胞接种至荷人黑色素瘤LiBr的SCID小鼠体内,17天后处死小鼠,将肿瘤组织进行抗BrdU免疫组化染色;水囊引产的胎儿四肢骨的骨髓源性的MSC进行分选、扩增、验证。PKH26染色后将MSC自鼠尾静脉接种至荷瘤(LiBr)的SCID小鼠体内,在荧光显微镜下观察肿瘤新生血管情况;将无PKH26染色的MSC自鼠尾静脉接种至荷瘤(B16)小鼠体内14天后处死动物,利用FISH技术和免疫荧光染色技术研究肿瘤组织血管生成情况。 3 通过结扎40只C57小鼠后肢股动脉构建局部缺血缺氧环境,并接种黑色素瘤,建立小鼠缺血后肢黑色素瘤移植瘤模型,对比研究缺血缺氧环境和正常环境下 张璃[5]2011年在《罗格列酮抑制胃癌细胞系的增殖、侵袭与逆转耐药机制研究》文中提出研究背景胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其治疗主要以手术、化疗、生物治疗等综合治疗方法。由于胃癌常发生侵袭转移,从而手术治疗复发率高,并且化疗药物毒副作用大、容易产生耐药。侵袭转移、多药耐药是导致胃癌化疗失败的重要原因,开发抗侵袭转移、逆转胃癌多药耐药和毒副作用小的新药具有重要意义。研究发现PPARγ(proliferateration-activated receptor gamma)配体参与脂肪细胞分化、调节糖代谢、调控细胞周期、诱导肿瘤细胞分化和凋亡等作用,发挥抗肿瘤效应。研究表明,PPARγ配体曲格列酮通过抑制NF-kB表达抑制结肠癌细胞的生长;罗格列酮(Rosiglitazone,ROS)能增强5-Fu抑制人肝癌细胞生长的作用。目前,罗格列酮对胃癌细胞的增殖、侵袭转移、多药耐药的影响及其机制的报道甚少。【罗格列酮抑制人胃癌细胞增殖与诱导凋亡的作用及其机制】目的:通过体内外实验研究ROS对人胃癌细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制。方法与结果:ROS能明显抑制MGC803细胞的增殖,12.5μmol.L~(-1)以上浓度的ROS可呈浓度和时间依赖性抑制MGC803细胞增殖;AO染色和流式细胞术检测结果显示ROS能明显诱导MGC803细胞凋亡,使细胞周期呈浓度依赖性停滞于G1期;免疫细胞化学染色法结果表明人胃癌MGC803细胞表达PPARγ,ROS作用MGC803细胞后能诱导bax、PTEN表达上调、bcl-2表达下调(P<0.05或P<0.01);ROS对MGC803细胞小鼠肾囊膜下移植瘤有显着的生长抑制作用(P<0.05),呈剂量依赖关系;18mg.kg~(-1)、30mg.kg~(-1)、50mg.kg~(-1)的ROS抑瘤率分别为35.2%、45.8%、62.9%; HE染色光镜下可见瘤细胞变性和部分瘤细胞凋亡,宿主肾皮质边界完整,30mg.kg~(-1) ROS的抑制率(45.8%)与2mg.kg~(-1)丝裂霉素的抑瘤率(45.5%)相当(P>0.05);且罗格列酮(50mg.kg~(-1))对荷瘤小鼠血糖、肝肾功能及结构无明显影响。结论:罗格列酮可抑制人胃癌MGC803细胞增殖及其小鼠肾囊膜下移植瘤的生长,其机理可能通过上调bax、PTEN,下调bcl-2蛋白在MGC803细胞中的表达,诱导细胞凋亡有关。罗格列酮(50mg.kg~(-1))对荷瘤小鼠血糖、肝肾功能及结构无明显影响,为罗格列酮临床应用的可行性提供了理论依据。【罗格列酮抑制人胃癌细胞迁移与侵袭的作用及机制】目的:研究罗格列酮(ROS)对人胃癌SGC7901与SGC7901/VCR细胞的迁移侵袭能力的影响,并初步探讨其可能机制。方法与结果:划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测结果发现, 40μmol.L~(-1)的ROS处理24h后,SGC7901与SGC7901/VCR细胞迁移与侵袭能力明显降低(P<0.05);RT-PCR、Western-blot检测结果发现40μmol.L~(-1)的ROS处理24h后,SGC7901与SGC7901/VCR细胞p-ERK1/2、Fra~(-1)蛋白表达和uPA与MMP-9 mRNA及蛋白表达明显下调,TIMP-3 mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),uPAR mRNA及其蛋白表达无明显差异(P>0.05);而Rac1-LIMK1-cofilin1通路相关的LIMK1、Rac1、Rock1、Pak1、cofilin1 mRNA及其编码蛋白在此两株细胞中的表达均下调(P<0.05)。结论:ROS能抑制人胃癌SGC7901与SGC7901/VCR细胞迁移、侵袭能力,其机制不但与罗格列酮能通过ERK/Fra~(-1)/uPA通路,下调p-ERK1/2、Fra~(-1)及uPA、MMP-9表达,上调TIMP-3表达有关,也与罗格列酮能通过阻断Rac1-Rock-Pak1通路,下调LIMK的表达,进而抑制cofilin的激活有关。【罗格列酮对人胃癌祼鼠移植瘤血管生成拟态、淋巴管生成的影响及其机理】目的:研究罗格列酮对人胃癌SGC7901细胞裸鼠移植瘤血管生成拟态及淋巴管生成的影响并初步探讨其分子机制。方法与结果:采用PAS-CD31双染计数血管生成拟态;免疫组化法检测D2-40的表达,计算微淋巴管密度(LVD)差异,结果发现罗格列酮可抑制人胃癌祼鼠移植瘤血管生成拟态和淋巴管的生成;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western-blot检测结果表明罗格列酮可下调MMP-2、MMP-9、VEGF-C及VEGFR-3,上调TIMP-2的在人胃癌裸鼠移植瘤组织中的表达,进而抑制人胃癌祼鼠移植瘤的生长。结论:罗格列酮可能是通过下调MMP-2、MMP-9,上调TIMP-2在人胃癌裸鼠移植瘤组织中的表达,抑制血管生成拟态生成;通过下调VEGF-C及VEGFR-3在人胃癌祼鼠移植瘤组织中的表达,阻断VEGF-C与受体VEGFR-3结合的途径抑制肿瘤淋巴管的生成。【罗格列酮逆转丝裂霉素对人胃癌SGC7901/VCR细胞多药耐药及机制】目的:在研究发现罗格列酮能在体内外抑制胃癌细胞增殖和侵袭转移的基础上,本项目进一步通过体内外实验观察罗格列酮能否逆转人胃癌SGC7901/VCR细胞对丝裂霉素C耐药性,并探讨其可能的分子机制。方法与结果:通过细胞生长曲线和MMT方法研究表明罗格列酮能抑制SGC7901细胞、SGC7901/VCR细胞的增殖及SGC7901/VCR细胞祼鼠移植瘤的生长,呈浓度依赖性(P<0.05);应用流式细胞术、AO-EB荧光染色、DNA梯度法检测表明罗格列酮联合MMC与其它各组比较在体内外能增强诱导SGC7901/VCR细胞的凋亡(均P<0.05);罗格列酮能部分逆转SGC7901/VCR细胞及其祼鼠移植瘤对MMC的耐药;通过Real time PCR和Western blot检测发现罗格列酮下调MDR1、p-Akt、Bcl-2基因及P-gp和上调Bax基因及其蛋白在SGC7901/VCR细胞及其祼鼠移植瘤组织中的表达。结论:罗格列酮能部分逆转SGC7901/VCR细胞及其祼鼠移植瘤对MMC的耐药,其机制与罗格列酮抑制MDR1基因/P-gp途径和通过PI3K/Akt信号通路下调p-Akt、Bcl-2和上调Bax在移植瘤组织中的表达,诱导凋亡有关。从而为临床应用罗格列酮抗胃癌治疗提供了理论基础,为胃癌治疗开辟新途径提供了思路。 董娜[6]2010年在《肺癌血管生成拟态的研究及与凋亡关系的初步探讨》文中研究表明目的：研究血管生成拟态(Vasculogenic Mimicy VM)在肺癌中的表达情况，并分析其与肺癌不同临床病理参数及预后的关系。研究凋亡在VM形成中的作用，确定有意义的凋亡指标。初步探讨VM及抗凋亡作为新的肺癌治疗靶点的临床意义。内容及方法：收集本院病理科2002-2008年肺癌手术标本HE切片500例，高倍镜下初步筛选VM阳性病例。运用免疫组化和组织化学双重染色技术检验VM阳性率。卡方检验VM阳性率在各临床病理参数间表达的差异。单因素及多因素生存分析VM对患者预后的影响。运用免疫组化染色分析各凋亡指标在VM阳性组及阴性组间的表达差异。Tunel法检测凋亡指数在VM阳性组与阴性组的差异。结果：1．光镜下观察HE切片筛选符合VM判断标准病例从500例肺癌患者中挑选出90例具有丰富的微循环血供，且具有VM及马赛克血管特征，临床及随访资料完整的病例。其中男性65例，女性25例；年龄25岁-78岁，中位年龄56.5岁；肿瘤直径0.5cm-10cm,病理类型鳞癌49例，腺癌7例，小细胞癌23例，类癌4例，大细胞癌7例；外科病理学分期Ⅰa期17例，Ⅰb期14例，Ⅱa期4例，Ⅱb期22例，Ⅲa期13例，Ⅲb期18例，Ⅳ期2例。有淋巴结转移34例。2. CD31,PAS双重染色技术确定90例病例中VM的表达情况经双重染色分析，90例微循环丰富的患者中VM阳性为32例，阳性率35.6％。另一方面，从500例肺癌角度计算阳性率为6.4％。VM阳性组中，远处脏器转移率81.25％，VM阴性组远处脏器转移率55.2％，两组差异具有统计学意义(χ2=4.678，P=0.031)。T1期VM阳性率52.2％，T2期41.9％，T3+T4期19.4％，叁者差异具有统计学意义(χ2=7.401，P=0.025)。VM与其他临床病理参数无统计学意义。3.90例患者生存分析结果将全部90例病例以VM分作两组，即VM阳性组和VM阴性组，Kaplan-Meier单因素生存分析两组的生存率，并行Log-rank检验，差异有统计学意义(VM阳性组和VM阴性组中位生存期分别为18个月和25个月，Log-Rank=5.955,P=0.015)；Cox多因素生存分析结果显示淋巴结转移(OR=0.512,P=0.023)和术后远处转移(OR=0.139,P=0.000)是肺癌患者独立的危险因素。4．各凋亡指标在VM阳性组与VM阴性组的表达在VM阳性组与阴性组，P53蛋白阳性率分别为53.1％和54.8％，两组差异无统计学意义(p>0.05)；Bd-2蛋白阳性率分别为25％和54.8％，两组差异有统计学意义(χ2=5.857，P=0.016)；Cyt-c蛋白阳性率分别为46.9％和38.7％，但两组差异无统计学意义(p>0.05)；Caspase-8蛋白阳性率分别为31.3％和9.7％，两组差异有统计学意义(χ2=4.474,P=0.034)；Caspase-9蛋白阳性率分别为21.9％和9.7％，两组差异无统计学意义(p>0.05)；Caspase-3蛋白阳性率分别为59.4％和32.3％，两组差异有统计学意义(χ2=4.661，P=0.031).Tunnel法检测到VM阳性组凋亡指数为(4.06±1.638)％，VM阴性组凋亡指数(2.47±1.663)%。二者差异具有统计学意义(t=2.805，p=0.008)。结论1．肺癌组织中存在血管生成拟态，且VM与肿瘤细胞血道转移及预后明显相关，VM阳性组的肺癌患者预后较VM阴性组差；同时VM与肿瘤的T分期有关，T分期越低，VM的阳性率越高，推断VM是发生在恶性肿瘤生长早期的事件。但VM与肿瘤的其他病理特征及患者的临床特征无关。2．凋亡促进蛋白及凋亡指数在VM阳性组较阴性组高表达，凋亡抑制蛋白在VM阳性组低表达，提示凋亡对于VM的形成具有一定的促进意义。3．对于VM患者，靶向治疗应同时考虑血管内皮细胞和肿瘤细胞两方面。此外，如果凋亡成为肺癌VM形成的始动因子，那么拮抗凋亡的抗体可望成为像EGFR抑制剂的靶向治疗药物。 刘志勇[7]2012年在《ZEB1在结肠癌血管生成拟态形成中的作用及分子机制探讨》文中研究指明研究背景和目的：结肠癌是常见恶性肿瘤之一。尽管近年来结肠癌的诊断和治疗方法都有了明显进展,但其死亡率并没有显着改善。血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)是新发现的一种肿瘤血供方式,与肿瘤的侵袭、转移和肿瘤患者预后密切相关。本研究旨在通过研究结肠癌中VM和临床病理参数的关系,分析其临床意义及预后价值,并进一步探讨ZEB1调控的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在结肠癌血管生成拟态形成中的可能作用机制。方法：1)通过CD34/PAS双重染色方法标记结肠癌组织中VM并观察其分布特点,分析其在结肠癌中的临床病理意义和预后价值。2)通过免疫组织化学染色方法检测人结肠癌组织中EMT转录因子ZEB1和EMT相关分子E-cadherin和Vimentin的表达并探讨ZEB1、EMT、VM叁者关系。3)通过体外叁维培养模型检测叁种不同分化程度结肠癌细胞系形成VM管道样结构的能力,并检测内皮相关分子VE-cadhern、Flt-1、Flk-1的表达。4)选取具有管状结构形成能力的结肠癌细胞,利用siRNA技术下调其ZEB1的表达,并观察ZEB1降表达对细胞管状结构形成能力及内皮相关分子表达的影响。5) Western blotting和免疫荧光染色检测ZEB1降表达对结肠癌细胞E-cadherin, Claudin-4, Vimentin, Fibronectin等EMT相关分子表达的影响。6)细胞划痕和侵袭实验检测ZEB1降表达对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7) Western blotting检测ZEB1降表达对结肠癌细胞表达干细胞相关分子CD44和Lgr5表达的影响。结果：1)结肠癌中存在VM这种不依赖于内皮细胞的微循环模式,其发生率为19.2%。2)VM与结肠癌患者的复发/转移、TNM分期和肿瘤分化程度有关(P<0.05)。VM多发生在TNM分期较高,肿瘤分化程度较低的病例,且VM阳性组患者的复发和转移的发生率较高。3)单因素分析结果表明VM、ZEB1表达和结肠癌患者总生存期有关。多因素分析结果表明ZEB1是结肠癌总生存期的独立预后因素(P<0.05)。4)免疫组织化学染色结果表明,VM阳性组结肠癌组织ZEB1表达较高；ZEB1阳性组的上皮标记分子E-cadherin低表达,而间叶标记分子Vimentin的异位表达率高(P<0.05)。5)VM与结肠癌的EMT标志分子表达有关,VM阳性组的上皮标记E-cadherin表达较低,而间叶标记Vimentin的异位表达率高(P<0.05)。6)体外叁位培养证实,叁种不同分化程度的结肠癌细胞系HT-29,SW480,HCT16中只有低分化的HCT116细胞能够形成VM样管状结构,并表达VE-cadherin、 Flk-1、Flt-1等内皮细胞相关分子。7)ZEB1降表达显着抑制HCT116细胞体外管道样结构形成能力,并逆转HCT116细胞的EMT表型,细胞从较强的间充质细胞特征转变为上皮细胞特征。8)ZEB1降表达使HCT116细胞间叶标记分子Vimentin和Fibronectin表达下降,而上皮标记分子E-cadherin, Claudin-4表达上调,且降低其侵袭和迁移能力。9)结肠癌细胞HCT116具有较强的“干性”,可以表达干细胞相关分子CD44和Lgr5。ZEB1降表达显着下调HCT116结肠癌细胞CD44的表达,而对Lgr5表达影响并不显着。结论：1)结肠癌组织中存在VM这种特殊的微循环模式。2)VM与结肠癌侵袭、转移等恶性生物学行为有关,且VM存在提示患者预后不良。3)ZEB1调控的EMT在结肠癌VM形成过程中发挥重要作用。4)VM形成可能和结肠癌细胞的“干性”相关。 张丽娜[8]2010年在《视网膜母细胞瘤血管生成拟态的初步研究》文中认为目的：探讨人视网膜母细胞瘤(Retinalblastoma, RB)中血管生成拟态(Vesculogenic mimicry, VM)的存在与否；在体外通过叁维培养,探讨缺氧在诱导RB细胞向内皮样细胞转化及VM形成中的作用；并利用RNA干扰(RNAi)技术构建针对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的shRNA慢病毒载体,研究HIF-1α在RB细胞(Y79)形成VM中的调控作用。方法：1.收集人RB临床标本,石蜡切片,HE染色、PAS/CD34双重染色观察RB中是否存在VM,及拟态血管密度(VMD)与肿瘤分期及分化程度的关系；采用免疫组织化学方法检测肿瘤干细胞标记物ABCG2,内皮细胞标记物AC133、特异性低氧反应元件HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表达。2.利用商品化的慢病毒载体Lentivirus构建针对HIF-1α的shRNA病毒载体,转染Y79细胞,72h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率,新霉素抗性筛选出稳定转染的Y79细胞,Westenblot及逆转录PCR的方法分别检测HIF-1α蛋白及mRNA的表达。3.在体外对Y79细胞进行缺氧培养；倒置显微镜下观察细胞形态的改变；通过Dil吞噬实验及免疫荧光检测内皮细胞标记物AC133的表达从而对由肿瘤细胞诱导而成的内皮样细胞进行鉴定；免疫荧光显微镜检测肿瘤干细胞与内皮样细胞的关系；通过叁维培养观察VM的形成能力；Westernblot及荧光定量PCR的方法检测HIF-1α、EphA2、MMP-2的表达。结果：1.在收集的33例人视网膜母细胞瘤石蜡标本中19例可见PAS阳性而CD34阴性的VM结构,统计分析结果显示未分化型RB的VM阳性率明显高于分化型,而各分期之间VM阳性率无明显差异。免疫组化结果显示：有VM存在的RB组织中可见部分肿瘤细胞ABCG2.AC133阳性表达且分布与VM的走形一致；统计分析结果显示：有VM组ABCG2、AC133阳性细胞百分比明显高于无VM组,并且HIF-1α、EphA2、MMP-2的表达也明显高于无VM组。2.阳性克隆PCR结果及测序结果均显示：针对HIF-1α的shRNA病毒载体构建成功；利用该病毒载体系统转染Y79细胞后未见明显的细胞毒性,抗性筛选出的稳定转染细胞其HIF-1α的蛋白及mRNA表达几乎被完全沉默。3.在体外缺氧培养后,部分Y79细胞失去悬浮生长的特性开始贴壁生长,呈长梭形或多边形；实验显示这些贴壁的细胞具有吞噬Dil-acLDL的功能并能表达AC133；在叁维培养基上缺氧能诱导Y79细胞形成网格状VM结构；Westernblot及荧光定量PCR结果显示：缺氧使Y79细胞HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表达明显增加。而在稳定转染HIF-1αshRNA的Y79细胞中未能观察到缺氧引起的上述变化。结论：1.低分化的RB组织中存在VM,且VM的密度与分化程度呈反比与临床分期无关。2.设计构建的HIF-1αshRNA慢病毒载体稳定转染Y79细胞后可以有效地实现对相应的内源性HIF-1αmRNA的降解。3.缺氧是RB血管生成拟态的主要诱导因素之一,HIF-1αshRNA慢病毒在体外具有抑制缺氧诱导Y79细胞形成拟态血管的作用。4.VM形成中的内皮样细胞可能来源于RB细胞中的干细胞。 王琳[9]2015年在《结肠癌转移相关基因-1上调TWIST1/2表达促进胃癌拟态血管形成》文中认为伴随着血管生成而形成的肿瘤血液供应是实体瘤发生发展的关键步骤。普遍认为只有内皮细胞可以形成血管,但当内皮依赖的血管生成不能满足肿瘤的快速增殖时,一种重要的替代供血方式出现,即由肿瘤来源的非内皮细胞形成血管样网络—血管生成拟态(Vasculogenic mimicry, VM)。VM是部分肿瘤增殖早期获得供氧的主要途径,对肿瘤的生长和转移具有重要作用。目前仅有一项临床研究表明抗血管内皮生长因子受体2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)拮抗剂改善胃癌(Gastric cancer, GC)患者预后,但其他多项研究均表明针对血管内皮的抗血管生成治疗药物(Bevacizuma环能完全解决肿瘤的治疗问题。应用抗VEGF治疗后,反而促进卵巢癌患者VM形成,提示当内皮依赖的血管生成被抑制时,VM可以作为一种重要的替代供血模式。大量临床与实验研究表明,黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胶质瘤等多种肿瘤中均存在VM;临床病理资料研究显示有VM的病人预后比无VM的病人预后差。但仅有少量研究探讨了VM在GC中的作用,VM主要出现在分化程度差的GC中,抑癌基因可以抑制VM形成,癌基因可促进肿瘤VM形成,因此,靶向促VM形成的癌基因,可有效抑制肿瘤的发生发展。结肠癌转移相关基因一1(Metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)是HGF/c-Met(Hepatocyte growth factor/Met tyrosine kinase receptor)信号通路活化的重要调节因子。我们前期研究表明MACC1高表达预示GC患者较差的临床预后,同时,我们发现MACC1通过HGF/c-Met信号通路促进GC细胞增殖,并通过上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)促进GC细胞侵袭和迁移。既往研究表明EMT可促进肿瘤进展,参与VM进程。HGF诱导MACC1核转位发挥生物学功能。因此我们假设 MACC1可能在GC的VM形成中发挥重要作用。已知EMT调控蛋白主要包括TWIST1和TWIST2。TWIST1可诱导EMT的发生,同时促进肝细胞癌的VM形成。TWIST2作为bHLH(basic helix-loop-helix)转录家族成员,与TWIST1具有90%序列同源性。TWIST2参与多种肿瘤的EMT发生,提示TWIST2也可能在VM形成中发挥重要作用,但关于TWIST2是否参与VM形成尚不清楚。我们假设MACC1通过核转位活化TWIST1/2信号通路促进GC的VM进程。VE-cadherin是最早发现的VM形成相关蛋白,其属于内皮细胞的黏附分子,具有激酶活性。有研究报道,沉默VE-cadherin可明显抑制VM条索样结构。E-cadherin是上皮细胞重要表型之一,其表达缺失被认为是EMT发生的重要标志。我们前期研究证实了MACC1下调E-cadherin表达。Sun等研究也证实TWIST1通过上调VE-cadherin表达,下调E-cadherin促进肝癌VM发生。说明"TWIST1/2-VE-cadherin"可能参与MACC1诱导的VM进程。已知,VEGFR2(又称Flk1/KDR)是VEGF促有丝分裂、促血管生成的主要调节因子,参与VM形成。TWIST1上调VE-cadherin和VEGFR2表达,促进肝癌VM发生。以上提示MACC1可能通过EMT相关信号通路,即"TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"促进肿瘤细胞表达内皮细胞相关标志物,最终形成VM。在本研究中,我们首次探讨MACC1是否与GC的VM形成相关,利用88例GC患者临床病理资料,分析MACC1与VM共表达对GC患者预后的影响。同时,我们利用GC动物模型和GC细胞株,验证MACC1在VM形成中的作用,证明" HGF/c-Met-MACC 1-TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"信号通路是MACC1促进GC VM形成的具体机制。第一部分胃癌中存在VM,其与MACC1共表达预示胃癌患者不良预后[目的]观察VM是否存在及其与临床预后的关系；探讨MACC1表达与VM之间的关系,及二者同时表达对临床预后的影响。[方法]收集88例由南方医科大学南方医院2005.1-2010.12间经姑息性手术切除,且随访资料齐全并经病理诊断为胃癌(Ⅳ期)的手术标本,并对临床病例资料和随访资料进行整理分析(随访患者总生存时间：是指接受手术治疗日起至任何原因死亡之间的时间,截至分析之日尚存活或未发生病情进展的患者将以他们最后一次取得联系的日期作为截止时间)；利用HE染色和CD31/PAS双染法观察88例GC组织中是否存在VM,并计数PAS/VM密度；利用透射电镜观察VM的超微结构：以免疫组织化学方法检测VM不同密度组中MACC1蛋白表达,分析二者之间的相关性及其与临床预后的关系,进行统计学分析。[结果]1)在88例GC标本中,发现38例(38/88,43.0%)GC标本具有典型VM结构；2)VM密度与肿瘤分化程度、转移灶数目及GC患者生存状态正相关；生存分析表明VM高密度组的GC患者生存时间更短；3)生存分析提示MACC1高表达,GC患者预后差；进一步结果提示,在MACC1与VM共阳性表达组的GC患者中,3年生存率仅为8.6%；而MACC1与VM共阴性表达组的GC患者,3年生存率为41.7%；4)单因素及多因素分析表明VM是GC患者重要的预后因子。[小结]1)VM主要存在于分化差、恶性程度高的低分化型GC中,提示VM与GC的恶性生物学行为相关；2)VM结构与Ⅳ期GC患者远处器官转移灶数目相关,提示VM与GC进展相关：3)VM密度与MACC1表达正相关,推测癌基因可能促进VM形成。第二部分MACC1上调TWIST1/2表达促进胃癌VM形成[目的]利用GC细胞系观察MACC1对VM形成能力的影响,利用GC动物模型进一步证明MACC1表达与VM形成的关系,分析其对TWIST1/2的调控作用。从分子层面研究VM形成的机制。[方法]我们前期已通过筛选GC细胞系,构建MACC1表达质粒(oxMACC1)和MACC1干扰质粒(shMACC1)。本部分研究通过购买TWIST1和TWIST2 siRNA质粒,转染GC细胞,获得TWIST1和TWIST2下调模型,qRT-PCR和Western blot鉴定转染效果；利用GC动物皮下瘤和转移瘤模型,分析MACC1不同表达组中VM密度及TWIST1/2蛋白表达改变；进一步利用Matrigel胶叁维培养模型分析MACC1对VM形成能力的影响,并分析沉默TWIST1或TWIST2后VM管状数目的变化。[结果]1)前期研究已成功构建GC裸鼠皮下瘤和转移瘤模型。本研究中发现,oxMACC1明显促进肿瘤增殖及VM管状形成,且上调TWISTl/2蛋白表达；shMACC1抑制肿瘤生长及VM形成,且下调TWIST1/2蛋白表达；在肺转移模型中,VM密度与肺转移灶数目呈正相关；2)在BGC-823和MKN-28两种GC细胞系中,MACC1过表达显着上调TWIST1/2表达,反之,MACC1沉默则有效抑制TWISTl/2表达;3)细胞叁维培养条件下,MACC1过表达促进GC细胞形成管状结构,MACC1沉默抑制这种作用；沉默TWIST1或TWIST2均可降低GC细胞形成管状结构的能力。[小结]1) MACC1促进GC动物模型的VM形成和GC细胞形成管状结构;2) MACC1可通过上调TWIST1/2表达促进GC细胞在叁维基质中出现VM管道化结构；3)前期研究已证实MACC1通过EMT促进GC细胞侵袭、迁移；在本研究中,我们进一步发现TWIST1/2蛋白是MACC1诱导GC细胞通过EMT途径促进VM形成的重要调节分子。第叁部分"HGF/c-Met-TWISTl/2-VE-cadherin/VEGFR2"通路参与MACC1诱导的VM进程[目的]分析MACC1对TWIST1/2转录水平的调控作用;探讨HGF/c-Met信号通路在MACC1诱导GC细胞成管能力中的作用,明确MACC1诱导GC细胞形成VM的分子机制。[方法]利用荧光素酶报告基因分析MACC1对TWIST1/2启动子活性的调控；利用MTT实验分析HGF激动剂(rhHGF)和c-Met抑制剂(PF-04217903)处理GC细胞的使用浓度,以Western blot检测细胞核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达变化；在叁维培养模型下,观察HGF激动剂和c-Met抑制剂对GC细胞VM管状结构形成能力的影响；进一步利用qRT-PCR、Western blot、流式细胞学检测在MACC1不同表达的GC细胞中,VE-cadheri、VEGFR2和E-cadherin的表达变化；以免疫组织化学方法观察GC动物皮下瘤及88例人类GC标本中VE-cadherin表达状态,分析其与MACC1二者间的相关性,最后进行统计学分析。[结果]1)在5对GC组织(癌及癌旁)中,癌组织的核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达明显高于癌旁组织;2) MACC1在特殊微环境下可与TWIST1/2启动子区结合并增强其转录活性；3)GC细胞经过24-48小时处理后,与初始细胞数目相比,20μM HGF激动剂诱导BGC-823细胞数量增加25%, MKN-28细胞数量增加15%; c-Met抑制剂分别处理BGC-823和MKN-28细胞,致半数致死量(IC50)浓度分别为22μM和2μM。Western blot结果可见HGF激动剂显着上调核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达；而c-Met抑制剂拮抗这一效应;4)叁维培养条件下,HGF激动剂促进GC细胞形成管道化结构,而c-Met抑制剂抑制这一进程；5) MACC1上调VE-cadherin、VEGFR2表达,且下调E-cadherin表达；6) MACC1表达及VM现象均与VE-cadherin (EMT表征蛋白)表达存在显着正相关。[小结]1) MACC1可与TWIST1/2的启动子区域结合并促进二者转录,上调其核内蛋白表达；2)HGF激动剂通过上调核内MACC1、TWIST1及TWIST2蛋白表达,促进GC细胞VM形成,而c-Met抑制剂则拮抗这一作用：3) QRT-PCR、Western blot及流式细胞学分析实验表明：MACC1上调VE-cadherin、VEGFR2表达,下调E-cadherin表达；4)MACC1表达及VM现象,均与VE-cadherin表达具有显着相关性,推测MACC1可能通过EMT调控因子TWIST1/2调节VE-cadherin表达,促使肿瘤细胞向肿瘤相关血管内皮细胞转化,即肿瘤相关血管内皮细胞(Tumor-associated endothelial cells, TAEs),最终形成VM。结论本文通过对人类GC临床标本进行回顾性分析,探讨MACC1表达与VM密度的关系,发现MACC1通过上调TWIST1/2表达促进VM形成,证明"HGF/c-Met-TWIST1/2-VE-cadherin/VEGFR2"是MACC1诱导胃癌VM进程的可能分子机制。其中包括所涉及的MACC1结合TWIST1/2启动子以及相应的组织、细胞在分子和功能学多角度的评价。 [1]. 小鼠黑色素移植瘤模型中血管生成拟态形成的时空变化及其分子机制的初步观察[D]. 张凡. 天津医科大学. 2004 [2]. 血管生成拟态在喉癌中的临床意义分子机制的初步探讨[D]. 王巍. 天津医科大学. 2010 [3]. 多结节性肝细胞癌中血管生成拟态的初步研究及其临床意义[D]. 梁骁. 广西医科大学. 2008 [4]. 黑色素瘤微循环模式及微环境变化对其影响的实验研究[D]. 张丹芳. 天津医科大学. 2006 [5]. 罗格列酮抑制胃癌细胞系的增殖、侵袭与逆转耐药机制研究[D]. 张璃. 南华大学. 2011 [6]. 肺癌血管生成拟态的研究及与凋亡关系的初步探讨[D]. 董娜. 天津医科大学. 2010 [7]. ZEB1在结肠癌血管生成拟态形成中的作用及分子机制探讨[D]. 刘志勇. 天津医科大学. 2012 [8]. 视网膜母细胞瘤血管生成拟态的初步研究[D]. 张丽娜. 青岛大学. 2010 [9]. 结肠癌转移相关基因-1上调TWIST1/2表达促进胃癌拟态血管形成[D]. 王琳. 南方医科大学. 2015参考文献：