论文摘要
旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑（Indels）效率相差较大（site1:32.0%;site2:7.9%;site3:69.5%）,编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定（site1:31.8%vs 32.3%;site2:7.4%vs 8.4%;site3:71.3%vs 67.8%）,编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响（49.2%vs 0%）。综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。
论文目录
文章来源
类型: 期刊论文
作者: 吴海波,边雪娇,贾丽玲,索伦
关键词: 靶向测序,基因编辑
来源: 畜牧兽医学报 2019年08期
年度: 2019
分类: 农业科技,基础科学
专业: 生物学
单位: 上海交通大学医学院附属第九人民医院,上海交通大学系统生物医学研究院
基金: 国家重点研发项目(2018YFC1003004)
分类号: Q78
页码: 1587-1595
总页数: 9
文件大小: 2133K
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