新发肾致病型鹅星状病毒的分离鉴定及弱毒株选育

论文摘要

星状病毒属于星状病毒科,为无囊膜、单股正链RNA病毒,广泛存在于人和动物群体中,是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原之一。家禽星状病毒感染,除引起腹泻和生长不良外,还可导致严重的致死性肝炎和肾炎等疾病。近年来,我国部分地区商品雏鹅群陆续发生高度致死性内脏痛风病,给养鹅业造成了巨大的经济损失。该病以组织脏器及腿部肌肉、关节覆盖大量尿酸盐沉积物为特征,主要感染3周龄以内的雏鹅,感染鹅群死亡率可高达30%。本研究对雏鹅内脏痛风病的致病病原进行了鉴定,同时开展了病原检测及防控方面的研究工作,对有效的防控鹅内脏痛风病具有重大的意义。本研究首先通过细菌学培养排除常见细菌感染,之后采用PCR技术从发病鹅病料中检测到星状病毒基因片段,并在此基础上开展病毒的分离和鉴定工作。将收集的死亡雏鹅病料处理后接种鹅胚,成功分离到一株鹅源星状病毒,并将该分离株命名为AAstV/Goose/CHN/2017/SD01。分离病毒SD01通过口服、滴鼻及皮下注射的方式感染健康雏鹅,可引起与临床病例相似的病症,实验感染雏鹅表现为精神沉郁、采食减少、拉稀等症状,发病率达50%以上,死亡率最高为23%,且存活雏鹅生长发育受到显著影响。RT-PCR检测结果表明,病毒对雏鹅组织有广泛的侵嗜性,感染雏鹅可通过粪便向外界环境持续排毒,排毒期持续12天左右。死亡雏鹅组织学检查可见病毒感染引起肾小管上皮细胞损伤及脑组织非化脓性脑炎,该实验结果最终确诊星状病毒感染是引起雏鹅致死性痛风的病原。为了了解新分病原的基因组结构组成、序列特征及分类地位,本研究对鹅胚繁殖第4代病毒的全基因组序列进行测定。结果表明病毒基因组全长为7175nt,包括5’UTR、3’ UTR及ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框,编码蛋白中含有星状病毒特征性的跨膜域、丝氨酸蛋白酶、核定位信号、核糖体移位信号及RdRp等结构,与经典星状病毒结构一致,同时含有保守氨基酸基序。同源性比较分析发现,SD01分离株与已报道的星状病毒同源性均低于70%;ORF2蛋白遗传距离比较显示该病毒与火鸡2型星状病毒、鸭1型星状病毒相对较近,小于作为星状病毒种间划分依据的0.576-0.741;进化分析显示病毒与火鸡星状病毒、部分鸭星状病毒等禽星状病毒处于同一分支;表明新分鹅源星状病毒与火鸡2型星状病毒等禽星状病毒划分为相同的种,但具有显著的遗传学差异。基于鹅源星状病毒的遗传学和生物学特性,本研究选用杆状病毒表达系统对SD01衣壳纤突蛋白进行表达,利用纯化重组蛋白免疫小鼠制备针对病毒衣壳蛋白的多克隆抗体及特异性的单克隆抗体,并以此为基础,建立了用于病毒抗原的检测和鉴定的间接免疫荧光及免疫组化方法。同时基于几种水禽常见星状病毒保守序列设计引物,建立了可用于水禽常见星状病毒检测的三重RT-PCR方法及用于鹅源星状病毒检测的荧光定量PCR方法。比较鹅源星状病毒在不同实验室宿主系统中的繁殖状态,选择鹅胚作为最佳的繁殖系统,将SD01在鹅胚中连续传代,选育获得了可在鹅胚中高滴度繁殖的弱毒株。动物感染实验结果显示,病毒传至60代（G-60）已经充分致弱,且在易感雏鹅体内连续传代未出现毒力返强现象。攻毒保护实验结果显示,雏鹅皮下接种5X107拷贝后10天可完全抵抗强毒攻击,保护率可达100%,雏鹅免疫后可产生高水平的中和抗体。对传代病毒全基因组序列进行分析和比较,发现病毒传代过程中共出现8个氨基酸突变,且突变位点主要集中于ORF2蛋白。综上所述,本研究成功分离到一株鹅源星状病毒,并证明该病毒是鹅内脏痛风的主要致病病原;建立了用于星状病毒检测的免疫学、分子生物学方法,并筛选出一株免疫原性好、安全可靠的弱毒疫苗侯选株。为进一步开展雏鹅星状病毒感染及致病机制、疾病诊断和免疫防治奠定了良好的科学基础。

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摘要

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缩略词表

第一章星状病毒感染概述

1.1 分类及病原学特征

1.1.1 病毒分类

1.1.2 分子生物学特征

1.1.3 衣壳蛋白结构及功能

1.1.4 星状病毒培养特性及抵抗力

1.2 流行病学

1.3 致病机制

1.4 跨种传播

1.5 重组现象

1.6 诊断方法

1.7 疫苗防控

1.8 研究目的与意义

第二章鹅源星状病毒的分离与鉴定

2.1 前言

2.2 材料

2.2.1 样本采集

2.2.2 鹅胚及试验动物

2.2.3 主要试剂耗材

2.2.4 相关溶液及配制

2.2.5 主要仪器设备

2.3 方法

2.3.1 细菌学检查

2.3.2 病毒学检查

2.3.3 病毒分离与毒价测定

2.3.4 雏鹅致病性实验

2.4 结果

2.4.1 自然感染病例的临床症状及病变

2.4.2 细菌分离

2.4.3 病毒学检侧

2.4.4 病毒分离与毒价测定

2.4.5 雏鹅实验感染

2.4.6 不同地区鹅源星状病毒分离及遗传学分析

2.5 讨论

2.6 小结

第三章鹅源星状病毒全基因组序列分析

3.1 前言

3.2 材料

3.2.1 毒株

3.2.2 主要试剂耗材

3.2.3 主要仪器设备

3.3 方法

3.3.1 引物设计

3.3.2 全基因组序列扩增

3.3.3 基因组两端序列扩增

3.3.4 全基因组序列准确性验证

3.3.5 基因组序列及相关结构分析

3.3.6 SD01遗传演化分析

3.4 结果

3.4.1 全基因组序列测定

3.4.2 SD01基因组结构分析

3.4.3 SD01保守氨基酸基序分析

3.4.4 纤突蛋白（Capsid spike）结构预测

3.4.5 SD01同其他种属星状病毒同源性分析

3.5 讨论

3.6 小结

第四章抗鹅源星状病毒衣壳蛋白单克隆抗体制备

4.1 前言

4.2 材料

4.2.1 毒株、细胞及试验动物

4.2.2 主要试剂耗材

4.2.3 相关溶液配制

4.2.4 主要仪器设备

4.3 方法

4.3.1 杆状病毒表达系统表达鹅源星状病毒衣壳蛋白

4.3.2 星状病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备

4.4 结果

4.4.1 杆状病毒表达系统表达SD01衣壳蛋白

4.4.2 衣壳蛋白单克隆抗体的制备

4.5 讨论

4.6 小结

第五章鹅源星状病毒PCR检测方法的建立

5.1 前言

5.2 材料

5.2.1 毒株

5.2.2 主要试剂耗材

5.2.3 主要仪器设备

5.3 方法

5.3.1 高致病水禽星状病毒三重PCR方法的构建

5.3.2 荧光定量PCR方法（探针法）建立

5.4 结果

5.4.1 三重PCR方法的建立

5.4.2 实时荧光定量PCR（探针法）方法构建

5.5 讨论

5.6 小结

第六章鹅源星状病毒弱毒株的选育及免疫原性研究

6.1 前言

6.2 材料

6.2.1 毒株、鸡胚及试验动物

6.2.2 主要试剂耗材

6.2.3 相关溶液及其配制

6.2.4 主要仪器设备

6.3 方法

6.3.1 星状病毒实验室繁殖系统的建立

6.3.2 星状病毒传代致弱

6.3.3 弱毒株免疫原性试验

6.3.4 传代病毒基因变异分析

6.4 结果

6.4.1 实验室繁殖系统构建

6.4.2 鹅源星状病毒弱毒株的选育

6.4.3 鹅胚传代病毒基因组突变分析

6.5 讨论

6.6 小结

第七章结论

第八章创新点

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张清水

导师: 苏敬良

关键词: 星状病毒,痛风,弱毒疫苗,单克隆抗体

来源: 中国农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业大学

分类号: S852.65

总页数: 132

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