苏靖芳[1]2017年在《烟草青枯病菌噬菌体分离鉴定及部分噬菌体基因组学研究》文中研究说明烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性土传细菌病害,烟株一旦染病即可造成整株死亡,成为制约烟草发展的重要问题。为减少该病带来的经济损失,我国在烟草生产中综合采用生物、化学、种植抗病品种、调整烟苗移栽期以及合理轮作等措施加以防治,虽然在一定程度上能够减少该病引起的损失,但由于青枯雷尔氏菌多样性高、寄主范围广、在土壤中生存能力强等原因,仍无法有效控制该病发生的危害。于是,人们开始探索一种新型有效的生物防治方法-噬菌体疗法,即利用噬菌体防治青枯病正成为研究的热点。因此发现并分离出一株新的烈性噬菌体对噬菌体疗法具有很大的应用价值。本研究以烟草青枯雷尔氏病菌TB15-14、TB15-15为宿主,采用双层平板法从烟田土壤中分离出青枯雷尔氏菌烈性噬菌体,利用透射电子显微镜观察噬菌体形态特征,双层平板测定噬菌体的生物学特性,采用RAPD-PCR克隆测序技术、高通量全基因组测序、基因组结构和比较基因组学分析等方法研究噬菌体遗传基因特征,为烟草青枯病噬菌体疗法提供技术储备,同时也为制备噬菌体制剂提供数据支持。主要研究结果如下:1.根据噬菌体噬菌斑大小的不同,从2株宿主菌中各分离获得3株噬菌体,经透射电子显微镜观察这6株噬菌体都属于有尾噬菌体目(Caudovirales),短尾噬菌体科(Podoviridae),将以TB15-14为宿主的噬菌体分别命名为RS-PI-1、-2、-3,以TB15-15为宿主的噬菌体命名为RS-PII-1、-2、-3。2.6株噬菌体的最佳感染复数差异不大,除一株噬菌体的感染复数为0.1外,其余均为1;噬菌体的一步生长曲线中表明,以TB15-15为宿主菌的噬菌体其潜伏期、爆发期和裂解量比以TB15-14为宿主菌的噬菌体大。3.6株噬菌体不适合高温环境,最佳作用温度在28~40℃之间;当pH值超过8以后对以TB15-15为宿主菌的噬菌体影响较大,6株噬菌体的最适pH在3~8之间,不适合碱性生活环境。4.通过随机扩增多态性分析发现,噬菌体片段RS-PI-3-1与Ralstonia phage RS-PI-1的亲缘关系最近,高达99%,Ralstonia phage RS-PI-1的比对蛋白为假想蛋白,因而推定噬菌体片段RS-PI-3-1也为假想蛋白。结合生物学特性分析推定噬菌体片段RS-PI-3-1为新的青枯雷尔氏菌噬菌体。噬菌体片段RS-PII-2-1与Ralstonia phage RS-PII-1的亲缘关系最近为94%,Ralstonia phage RS-PII-1的比对蛋白为DNA解旋酶,因而推定噬菌体片段RS-PII-2-1为DNA解旋酶。通过系统进化树的分析发现噬菌体片段RS-PII-2-1与Ralstonia phage RS-PII-1的bootstrap值仅为78%,因而推定噬菌体片段RS-PII-2-1为新的青枯雷尔氏菌噬菌体。5.对噬菌体RS-PI-1和噬菌体RS-PII-1的全基因组测序结果显示,它们都都属于双链闭合环状噬菌体。噬菌体RS-PI-1的核苷酸序列全长为43211 bp,GC含量为61.5%,含有48个开放阅读框;噬菌体RS-PII-1的核苷酸序列全长42042 bp,GC含量为63.2%,有46个开放阅读框,对2株噬菌体进行全基因组氨基酸比对,并通过噬菌体保守区域构建系统进化树,结果显示两株噬菌体覆盖度仅有10%,覆盖区相似性为78%,与其它的青枯雷尔氏菌噬菌体通过系统进化树和全基因组比较存在一定的差异,因此推定噬菌体RS-PI-1和噬菌体RS-PII-1为两株全新的烈性青枯雷尔氏菌噬菌体。
潘哲超[2]2010年在《植物青枯菌遗传多样性及致病力分化研究》文中研究指明植物青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的世界性重要细菌性病害,寄主范围极为广泛,可侵染54个科的450余种植物;不同地理起源的青枯菌在与其寄主长期协同进化的过程中,演化出明显的生理分化或菌系多样性。传统的分类将青枯菌划分为5个生理小种和5个生化变种,但传统的分类框架不能反映青枯菌的遗传进化及与地理起源的相关性。Fegan和Prior(2005)共同提出了演化型分类框架用于描述青枯菌种以下的分类,得到了国际上的广泛认可。我国迄今为止尚未开展青枯菌演化型分类鉴定的相关研究,本研究采用国际上最新的青枯菌演化型分类框架,对我国青枯菌进行了遗传多样性分析,同时基于遗传多样性分析结果,以遗传背景相近但寄主范围存在明显差异的菌株为研究对象,运用抑制差减杂交技术和蛋白质双向电泳技术筛选寄主适应性基因,旨在探究中国青枯菌菌系生物学特性、进化关系及致病力分化,从而为改进育种策略、发展分子检测技术及青枯菌致病机制研究奠定基础。1.青枯菌遗传多样性研究本研究分别在演化型和序列变种两个分类水平上对中国青枯菌群体进行了种以下分类研究。在演化型分类水平上,揭示出来自13个省、18个寄主的286个参试菌株全部属于青枯菌演化型I和II型,即亚洲分支和美洲分支菌株。在序列变种分类水平上揭示出中国青枯菌群体具有丰富的遗传多样性,存在着亚洲分支的10个序列变种及美洲分支的1个序列变种。其中亚洲分支菌株中的序列变种33、44和48为国际上首次鉴定出的新序列变种。2.青枯菌致病力分化研究在序列变种鉴定过程中,发现了在致病力分化上具有重要意义的来自马铃薯的Po82菌株,与寄主范围差异很大的香蕉青枯菌及NPB(not pathogenic to banana)菌株同属序列变种4。AFLP聚类分析的结果显示:Po82在亲缘关系上与NPB菌株更近;SDS-PAGE分析Po82胞外泌出蛋白谱带类型与香蕉青枯菌菌株更为接近。致病力鉴定结果表明:Po82能够侵染茄科植物的番茄、茄子及马铃薯,且兼具对香蕉的致病力,是迄今为止发现的第一株可对香蕉致病的来自马铃薯的菌株,从而表明Po82是一个进化地位上极为独特的菌株。3. SSH筛选青枯菌寄主适应性基因利用抑制性差减杂交技术,构建了4个不同类型的差减文库:马铃薯菌株(Po82)/香蕉青枯菌(2号小种,RUN92)、马铃薯菌株(Po82)/NPB菌株(RUN292)、姜青枯菌(4号小种,Z1)/广寄主菌株(1号小种,GMI1000)及桑青枯菌(5号小种,M7/M2/M3)/广寄主菌株(1号小种,GMI1000),筛选获得了不同差减库的特异性核苷酸片段,其功能主要涉及跨膜蛋白、转录调控蛋白、信号肽、假设蛋白以及未发现同源性的片段等几大类。桑青枯菌的3个差减文库中均含有大量携带IS插入元件IS1420和ISRso15的差异性片段,在GMI1000(1号小种)及其它已测序的小种中均未发现IS1420元件,在GMI1000中仅存在2个ISRso15元件,推断其可能与桑青枯菌寄主适应性有关。此外,基于差减片断MG67成功地建立了桑青枯菌(5号小种)的PCR检测体系。4.桑青枯菌Ш型分泌系统突变株的构建及其泌出蛋白分析通过同源置换法构建了GMI1000△popP1和桑青枯菌M7△hrpB突变株,利用蛋白质双向电泳技术,分析比较了M7与突变株M7△hrpB泌出蛋白的差异,为进一步筛选桑青枯菌(5号小种)的Ⅲ型效应蛋白奠定了基础。利用演化型及序列变种分类单元对青枯菌遗传多样性的研究,明确了我国青枯菌种以下的分类地位,发现了3个新的序列变种;发现了进化地位十分特殊的Po82菌株可对香蕉致病;桑青枯菌中大量插入子元件的存在可能与其寄主适应性相关;上述研究对青枯菌致病力分化及致病机理研究具有重要意义。
辛玉峰[3]2004年在《Ralstonia sp.Strain U2和Pseudomonas sp.WBC-3系列菌的趋化性研究》文中指出微生物的趋化是微生物向着合适于它生存或者生长的环境污染物浓度的一种运动。趋化可能是其降解的前奏，它可以在某种程度上加速降解的进程。趋化是微生物在营养不足或者是污染物存在下的一种选择优势，研究趋化的机理，可以使我们更了解微生物进行自身的改造而更适应于恶劣的环境的进程。本论文主要内容共分为叁章：第一章综述了环境污染的现状，主要集中在芳香烃的危害上，讨论了微生物治理环境污染在几种治理方法上的优势。并且对微生物的趋化和现状和研究进展进行了综述，阐明了现在对于微生物趋化的机理的几种解释。第二章从实验的角度，证明了Ralstonia sp. strain U2向着它的底物萘，以及其它的化合物如水杨酸，琥珀酸，龙胆酸等的趋化的特性。并且克隆了其中的趋化基因－甲基趋化受体蛋白基因，并在大肠杆菌中进行表达，得到和预测理论值相吻合的目的蛋白带。利用趋化分析方法初步分析了此基因在趋化中的作用。第叁章以实验证实了Pseudomonas sp. WBC－3以及它的质粒转移菌和质粒消除菌对于甲基对硫磷等化合物的趋化特性。WBC-3菌的代谢质粒在其趋化中起到了一定的作用。而且证实它的趋化和其代谢之间没有必然的相关。
李静泉[4]2012年在《3，5，6-叁氯-2-吡啶醇降解菌Ralstonia sp.strain T6的分离与鉴定及降解特性和降解机制研究》文中进行了进一步梳理3,5,6-叁氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol, TCP)是除草剂绿草定和杀虫剂毒死蜱及甲基毒死蜱的主要降解产物,广泛存在于环境中。在土壤中,由于TCP比毒死蜱吸附性差而稳定性和水溶性强,所以有着更强的渗透性。食入TCP对人体有危害,TCP尤其会对眼睛造成严重的损害,此外TCP对水生和陆生生态区有着低到中度的毒害作用,对生态系统影响较大。虽然通过物理和化学方法可降解TCP,但相比之下由于TCP微生物降解具有高效性,低成本,环境友好型等特点,使其在TCP环境污染治理方面更具有潜力。到目前为止,有关TCP微生物降解报道较少,因此分离和丰富TCP降解菌种资源具有十分重要的意义,本研究通过富集培养的方法分离得到一株TCP降解菌T6,然后对其进行了菌种鉴定及降解特性和降解机制研究。从污水处理池中采得活性污泥样品,通过富集培养的方法分离得到一株稳定的3,5,6-叁氯-2-吡啶醇(TCP)降解菌T6。菌株T6为一短杆状的革兰氏阴性菌,结合对菌株T6进行的16S rRNA基因序列比对和系统进化树分析,将其初步鉴定为Ralstonia sp. strain T6。Ralstonia sp. strain T6对TCP具有高效的降解速率,能够在1h内将10mg/LTCP完全降解,在12h内将100mg/L TCP完全降解,在80h内将700mg/L TCP完全降解。Ralstonia sp. strain T6降解TCP的最适pH值和最适温度分别为8和30℃。K+对Ralstonia sp. strain T6降解TCP有促进作用；Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+对TCP降解没有明显的影响；Zn2+、Co2+、Ni2+对TCP降解有明显的抑制作用；Cu2+则完全抑制Ralstonia sp. strain T6对TCP的降解。利用硝酸银滴定法,液相色谱——质谱联机等检测手段将TCP降解过程中产生的绿色中间体初步鉴定为3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。通过简并引物从Ralstonia sp. strain T6的基因组中成功扩增出利用FADH2的单加氧酶基因(tcpA)的部分序列,利用基因打靶技术将tcpA插入失活,突变菌株(T6-ΔtcpA)失去了降解TCP的能力但仍能够降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。推测Ralstonia sp. strain T6中参与TCP降解起始的基因位于tcpA基因序列的上下游。利用SEFA PCR技术扩增tcpA的侧翼序列,克隆到一段由3个基因组成的tcp基因簇。将tcp基因簇中的3个ORF分别命名为基因tcpR,tcpX和tcpA,长度分别为972bp,552bp和1554bp,其中TcpR和TcpX分别与LysR家族转录调节因子(LysR family transcriptional regulator)和黄素还原酶(flavin reductase)有着较高的一致性,黄素还原酶可将NAD(P)H中的H传递给FAD而生成FADH2。随后通过对突变体T6-ΔtcpA中插入失活的基因tcpA进行功能互补实验验证了互补菌株T6-ΔtcpA-com恢复了对TCP的降解功能,说明菌株T6中的tcpA基因确实为TCP降解起始阶段的关键基因,TcpA催化TCP生成绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。同时TcpA为依赖于FADH2的单加氧酶,因此推测在TcpA催化TCP降解过程中TcpX发挥着黄素还原酶的功能,为TcpA反应提供所需的FADH2,而TcpR对降解起着调节作用。通过对菌株T6进行随机插入失活突变子文库构建,成功筛选出4个突变子,在功能上都已不能降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。通过侧翼序列扩增,得到了一段长约5.9kb的片断。经过序列分析,认为这一段序列中的4个基因组成了菌株T6中进一步降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮的thp基因簇。将thp基因簇中的4个ORF分别命名为基因thpR, thpI, thpJ和thpK,长度分别为900bp,717bp,879bp和1251bp。通过构建异源重组表达载体和诱导表达的方法分别检测ThpJ和ThpI的粗酶液活性,结果发现ThpJ对绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮有很好的降解活性,能将其完全降解并生成一种新的中间体5-氧基-2,4,5-叁羰基正戊酸；而ThpI能将5-氨基-2,4,5-叁羰基正戊酸进一步进行降解,可以看出ThpJ和ThpI能够先后对TCP降解中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进行有效的降解。同时根据蛋白质序列同源性分析,推测ThpR和ThpK分别在thp降解基因簇中起着调节和物质运输的功能。综上所述,菌株T6中TCP降解相关基因簇tcp基因簇和thp基因簇能够先后对TCP进行有效降解,其中tcp基因簇主要负责TCP降解初始阶段绿色中间体3,6--羟基吡啶-2,5-二酮的生成,thp基因簇能够对3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进行进一步的有效降解,从而实现菌株T6对TCP的彻底降解。
胡佳丹, 张玉苍, 林昭华, 华美云, 邓叁喜[5]2017年在《皮氏罗尔斯顿菌对香蕉假茎脱胶研究》文中认为以腐烂香蕉假茎中分离的皮氏罗尔斯顿菌Ralstonia sp.ZLXH-4为研究对象,对其产酶条件进行优化,鉴定该菌株的脱胶效果。通过单因素结合正交实验探讨培养基初始p H值、摇床转速、培养基葡萄糖浓度对果胶酶活性的影响,以DNS法测定果胶酶活性。在最佳产酶条件下,研究皮氏罗尔斯顿菌对香蕉假茎的脱胶效果。得到皮氏罗尔斯顿菌产果胶酶的最佳条件为p H7、摇床转速120 r/min、葡萄糖浓度15 g/L,应用于脱胶研究,香蕉假茎的残胶率为27.11%。以傅里叶红外光谱、扫描电镜和热重分析仪对脱胶产品进行了结构和热稳定性表征,表征显示纤维产品的胶质得到有效去除,热稳定性提高。结果表明,Ralstonia sp.ZLXH-4产果胶酶量较高,对香蕉假茎脱胶效果良好,对香蕉纤维的破坏较小。
种斌[6]2010年在《烟田土壤青枯菌的分子检测技术及应用》文中研究表明烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt disease)是由茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的一种广泛分布于世界热带、亚热带和一些温暖地区严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害,特别是对连作烟草的危害更为严重,常常对烟草生产造成巨大的经济损失。Ralstonia solanacearum随植株病残体遗落于土壤中成为植物青枯病的主要侵染源,主要从根部侵入,定殖于维管束内。田间的青枯病往往能够在高温高湿条件下迅速爆发成灾,烟株表现整株性枯萎、死亡以及根茎系统的坏死。由于目前缺乏高抗青枯病的品种以及效果显着的药物,对青枯病的防治主要依靠农业防治和综合防治,而且烟草青枯病的一旦发病则很难治理,因此能够快速、准确地检测田间土壤中Ralstonia solanacearum的数量则能够为该病的测报、防治设计、防治效果的评价以及品种抗性评价提供重要的科学依据。传统上烟草青枯病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究旨在运用PCR技术,建立土壤中Ralstonia solanacearum的分子检测体系,并初步应用于检测连作烟田土壤青枯菌的越冬基数、烟草生长季节青枯菌的早期侵染情况、不同地块青枯病流行风险分析、不同防治措施的防病效果评价等方面。主要研究结果如下:1.采用常规的细菌学方法分离鉴定了连作烟田土壤中的青枯菌。2.筛选了青枯菌的PCR检测引物,并据此建立了灵敏特异的植物青枯病菌PCR检测体系。研究结果表明,基于青枯菌16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2,以及基于青枯菌致病性相关基因的特异性引物对Ralflic-F/R,具有灵敏稳定的检测效果。利用优化的青枯菌PCR检测体系,两对引物对的PCR扩增产物大小分别为145bp、724bp,完全符合预期大小。该检测体系特异性强、灵敏度高,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μl,相当于100cfu/mL,适于土壤及其它材料中的Ralstonia solanacearum检测。3.比较了6种提取土壤总DNA的方法,并探索出了一种制备高质量土壤总DNA的方法,有效解决了土壤腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重金属、不明沉淀物、菌体裂解成分和RNA等抑制后续PCR反应的技术性问题。4.构建了土壤青枯菌半定量检测的分子检测体系。对来自田间土壤样品进行了实际检测结果证明了该分子检测体系是稳定可靠的。对来自重庆黔江新华乡的54个田间土壤样品检测结果与田间发病情况基本一致。首次运用该技术还分析评价了连作烟田Ralstonia solanacearum的越冬预警、早期侵染诊断以及农业防治措施的防病效果。
林海云[7]2012年在《青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）致病性差异及其相关基因的分析》文中研究说明青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是世界性分布的重要植物病原菌，对许多重要的经济作物和观赏性植物可造成严重的危害。该基因组约5.8Mb，具有高（G+C）含量和约5120个可能的编码基因，其致病性机制相当复杂。主要的致病因子有hrp编码的Ⅲ型分泌系统产物、胞外多糖、胞外蛋白、细胞壁降解酶包括果胶质酶以及纤维素酶等，其涉及到的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因；青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）、Ⅱ型分泌系统（T2SS）等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。而上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的，并以phcA调节基因的启动和转录为核心，自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭，从而控制细菌的生长状态。本研究利用特异性引物鉴定出85株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌，这些菌株均在504bp位置出现特异性条带。同时，采用BOX插入因子PCR（BOX-PCR）和重复基因外回文序列PCR（REP-PCR）对这些菌株进行基因多样性研究，基于它们的所扩增出的基因指纹图谱表明，BOX-PCR扩增出19条特异性条带，REP-PCR扩增出20条特异性条带。系统聚类结果表明，青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性。其中，寄主植物是在遗传差异中起主导作用。进一步分析可知，地域性的差异主要由BOX-PCR提供，寄主间的差异主要由REP-PCR提供。同时不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带，不仅如此，在REP-PCR中，同样具有与各个寄主相对应的特异性条带，利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌。因此，BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径。青枯雷尔氏菌的弱化指数（PI=D1/D2，PI:青枯雷尔氏菌弱化指数，D1:青枯雷尔氏菌菌落红边直径，D2:青枯雷尔氏菌菌落白边直径）与致病性存在着特定的相关性，弱化指数<0.714，被接菌的番茄苗基本上是重度死亡，定义为强致病力青枯雷尔氏菌；弱化指数的范围为0.714-0.833，被接菌的番茄苗基本上是中度死亡，定义为过渡型青枯雷尔氏菌；弱化指数>0.833，被接菌的番茄苗基本上是不死亡，定义为无致病力青枯雷尔氏菌。致病性检测的结果基本上是符合弱化指数分类的结果，这就进一步表明，青枯雷尔氏菌的致病性与其弱化指数有着直接联系。青枯雷尔氏菌致病性机制相当复杂，hrp基因簇在不同致病性青枯雷尔氏菌中差异不大，而phcA基因在青枯雷尔氏菌致病性上起着至关重要的作用。本研究发现在无致病力青枯雷尔氏菌的phcA基因中插入的ISRso21序列可能导致phcA基因的失活中，因此使被插入的菌株呈现出无致病力特性。福建闽北地区ISRso21的阳性率高于其他地区，不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布是有显着性差异的。因此，ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此，由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同，从而导致该致病性的差异。ISRso21的插入位点并不是定向的，它可以在多个插入位点插入。此外，编码共合体决定蛋白T基因、甲基转移酶、整合酶催化基因、依赖DNA的RNA聚合酶基因、PBCV-1DNA连接酶基因、编码HK97家族噬菌体蛋白基因、caudovirus前体蛋白酶和hypothetical protein Bmul_0496基因同样也可能在致病性上起着重要作用。利用弱化指数结果、致病性检测结果以及致病性相关基因结果筛选出7株不同致病性青枯雷尔氏菌典型代表菌株，进一步对其生理生化特性进行比较。不同致病性青枯雷尔氏菌的生长速率有所差异，不同致病性青枯雷尔氏菌吸收峰的位置和最大吸收峰的吸光度的值有所不同。同时，不同致病性青枯雷尔氏菌所分泌的胞外蛋白的种类也有所不同，其中强致病力青枯雷尔氏菌所分泌蛋白种类最多，而无致病力青枯雷尔氏菌最少。
张冲[8]2013年在《花生抗青枯病分子机理初步解析》文中研究说明花生是我国重要的油料和经济作物,由青枯雷尔氏菌引起的青枯病是花生最重要的土传性细菌病害,是影响花生产量和品质的关键因子之一,目前还没有行之有效的化学防治手段。解决青枯病最有效的手段是培育抗病品种,但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在周期长、抗性与高产优质负相关等问题,利用分子育种技术培育高产优质抗青枯病花生品种是有效解决花生受青枯病侵染的有效途径。目前国内外对花生抗青枯病的分子机理研究甚少,对控制青枯病的抗性基因数目、作用机制、花生-青枯菌互作的机理还不清楚。随着全基因组测序和功能基因组学的迅速发展,通过正反向遗传学的方法克隆花生抗青枯病基因,剖析花生-青枯菌的互作机制成为必然,由于花生的基因组庞大,通过正向遗传学图位克隆花生抗青枯病基因和解析花生抗青枯病的机理较为困难。因此,本研究旨在通过反向遗传学手段找到与青枯病相关的抗病基因,再通过转基因验证其功能,分析其抗病调控网络,这将有助于揭示花生抗青枯病分子机理,促进花生抗青枯病遗传改良。主要研究结果如下:1.采用蛋白质组学的方法对抗感青枯病花生品种在青枯菌侵染后的叶片的蛋白质组进行了比较。根据对青枯菌侵染的不同反应,筛选出了高抗的粤油92栽培种和高感的新会小粒栽培种。分别对两个品种4周大的幼苗用剪叶法进行青枯菌侵染,然后从受侵染的植株叶片中提取蛋白质,进行双向凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、质谱分析、蛋白数据库比对。和各自的对照组相比,抗、感品种中共发现14种差异表达蛋白。这些蛋白中,有5个是诱导产生的,4个表达上调,2个表达下调,3个差异表达相反。这些蛋白主要参与光合作用、能量代谢、信号转导以及防御反应。总之,本研究为探明花生青枯病抗性的分子机制提供了新的见解。2.通过基因芯片技术在花生上比较筛选可能与青枯病抗性相关的基因。为了鉴定抗性有关的转录本的变化,本实验根据花生全组织、花生生物和非生物胁迫的454测序结果整合Genebank上的EST序列合成了包含有101,344条unigenes的高密度的cDNA芯片(Roche NimbleGen基因表达芯片),比较抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA芯片杂交结果分析了两个品种的表达谱差异,经过t检验FDR≤0.05,选择log2≥1或者log2≤-1为差异基因,青枯菌侵染后,抗病品种粤油92有2,638个基因表达上调,1,410个基因表达下调,在感病品种新会小粒中,有1,551个基因表达上调,2,054个基因表达下调,通过5个差异基因的qRT-PCR验证了芯片的可靠性。GO注释和pathway分析显示抗感品种中差异基因功能注释的结果差异较大,参与的代谢途径感病品种中参与的差异基因较多。一些与抗病相关的重要基因如NBS-LRR类抗病基因、转录因子和激酶类基因在抗病品种上调的较多,而在感病品种中下调的较多,这些基因的差异表达可能与青枯菌侵染花生后的防御应答有关,可能参与了花生的青枯病的抗性。3.富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLK)具有调节植物生长发育、参与抗逆反应和防卫反应等生理功能。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导差异表达上调的LRR-RLK类抗病基因AhRLK1,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,292bp,编码992个氨基酸,对其结构分析表明具有一段信号肽、一个胞外激酶区和9个LRR保守结构域,农杆菌渗入法注射烟草叶片对其亚细胞定位显示35S::AhLK1-GFP融合蛋白定位于细胞膜上,通过荧光定量对其表达模式分析结果表明,AhRLK1在青枯菌侵染后在感青枯病花生品种新会小粒持续上调表达,而在抗病品种粤油92中变化不大,SA、ABA、ET、JA、PAC激素处理后能上调表达,在干旱和低温处理中下调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRLK1明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRLK1超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtHPR3,NtHPR4,NtCHN50,NtPR1b,NtPR2,NtEFE26和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRLK1可能参与花生对青枯菌的防御反应,可能参与青枯菌侵染早期对病原菌的识别,还参与了植物的非生物胁迫防御反应。AhRLK1基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。4.NBS-LRR类抗病基因是目前已知的植物抗病基因最大家族,在植物的抗病防御反应中起着重要作用。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导上调表达的NBS-LRR类抗病基因AhRRS5,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,157bp,编码943个氨基酸,对其结构分析表明具有典型的NBS-LRR类保守结构域,基因枪法转化洋葱表皮实验表明,35S::AhRRS5-GFP融合蛋白定位于细胞核中,荧光定量结果表明,AhRRS5在青枯菌侵染72h内抗感花生品种中都能上调表达,在感病材料中表达上调的幅度较大,受SA、ABA、ET、JA、PAC激素的上调表达,在干旱和低温处理中也能上调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRRS5明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRRS5超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtPR1b,Ntla/c,NtNPR1,NtEFE2 和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRRS5可能参与花生对青枯菌的防御反应,并且是通过多种信号途径复杂的调控网络实现的。AhRRS5基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。
She, Xiaoman, Lan, Guobing, Yu, Lin, Tang, Yafei, Li, Zhenggang[9]2018年在《Genome sequence of Ralstonia solanacearum species complex phylotype Ⅰ strain RSCM isolated from Cucurbita maxima》文中提出Ralstonia sp.Strain U2和Pseudomonas sp.WBC-3系列菌的趋化性研究
徐燃[10]2013年在《青枯菌侵染广藿香的致病过程及诱导寄主抗病性研究》文中认为本文以从感染了青枯病的广藿香植株中分离的青枯菌HX6、HX2及感病番茄植株中分离的青枯菌GIM1.7为供试菌株,研究青枯菌在广藿香根表的吸附及从根部入侵、定殖的过程,并观察了青枯菌侵染后寄主植物的组织病理学特征;探讨了影响青枯菌致病的因素,并对青枯菌GIM1.7的PliC致毒相关基因进行了克隆和序列分析。在此基础上,考察了不同青枯菌菌株诱导的广藿香防御相关酶活性及其同工酶酶谱的动态变化,以探讨广藿香对青枯菌侵染的抗性生理反应。本研究旨在揭示广藿香青枯菌的致病及寄主的防病机制,为广藿香青枯病的综合防治提供参考。本研究主要结果如下:1国内外研究评述在大量阅读国内外文献的基础上,介绍了广藿香的研究概况;总结了青枯菌的生长特性、致病机制及基因组学等的研究;并概述了寄主植物对病原菌的防御机制。2.青枯菌对广藿香根部的吸附与侵入研究分别测定广藿香青枯菌菌株HX6及番茄青枯菌菌株GIM1.7在广藿香根表的吸附情况。结果表明,青枯菌HX6在广藿香根表的吸附量高于青枯菌GIM1.7,说明青枯菌对原寄主的吸附亲和性高于其他寄主植物。电镜观察发现青枯菌HX6侵染广藿香24h后,青枯菌及其胞外分泌物在植株根部出现,48h时后,在茎部导管出现。3.青枯菌入侵广藿香的组织病理学观察观察青枯菌侵染后广藿香植株1-7d的表形的变化,可看到侵染1d后植株少量叶片收缩下垂,2d后大部分叶片萎蔫,色泽稍变浅;3d后植株茎杆弯曲,倒伏;4d后整株植株萎蔫死亡。利用光学显微镜观察青枯菌HX6侵染的广藿香组织病理学特征。结果表明,青枯菌入侵造成植株茎部导管离析、扭曲及破裂,随之,叶肉组织也逐渐破坏,植株死亡。这与感染植株的表型变化较为一致。4.影响青枯菌对广藿香致病的因素以青枯菌HX6为供试菌株,分别对伤根及不伤根的广藿香试管苗进行侵染试验。结果表明青枯菌侵染后,伤根的广藿香植株发病更快,但不伤根的处理也表现发病症状,且随着侵染时间的延长,不伤根处理病情指数迅速增加,侵染后期,两种处理的病情指数均达100。表明青枯菌在根表聚集后,除了从根表伤口侵入外,还可通过分泌一些胞外酶等物质破坏寄主细胞壁,再从破坏的根表细胞进入植株体内。最终枯萎死亡。将广藿香试管苗分别接种至含菌体、菌液或粗毒素培养基上,观察7天内植株的生长情况,结果表明,在含菌体的培养基上的大部分植株没有明显的发病症状,而菌液与粗毒素处理组,植株茎叶逐渐萎蔫,说明青枯菌胞外分泌物是青枯菌致病的重要因素。5青枯菌(GIM1.7菌株)的Pi/C基因的克隆及序列分析对已知青枯菌序列(NCBI数据库)进行生物信息分析,从寻找到的分泌蛋白中挑选出第 4 型菌毛形成 pilyl-相关蛋白(type-4 fimbrial biogenesis pilyl-related protein)推测其可能为致病相关因子,依据为:1.该基因编码蛋白N-末端有信号肽序列,确定为分泌蛋白;2.该蛋白有类似甜味蛋白thaumatin结构域,该结构域分子已知可能通过影响膜的渗透性而导致植物致病;3.该分子的后半段含有类似奈瑟氏菌属PilC beta螺旋区,这区域可能与病原性菌粘附于靶细胞相关。青枯菌识别吸附为病菌致病的重要前提,因此选取表达该蛋白的PilC基因片段为目的基因,从青枯菌菌株GIM1.7中成功克隆了 PilC蛋白基因。6青枯菌诱导的广藿香防御相关酶活性分析以广藿香青枯菌HX6、HX2及番茄青枯菌GIM1.7为供试菌株,对广藿香进行侵染诱导试验,考察诱导7d内防御相关酶活性的变化。结果表明,未经诱导的对照植株的3种防御酶活性表现处于较低的水平且表现平稳。诱导处理的植株POD、PPO、PAL酶活性均明显高于对照,且表现为先升高,再下降的趋势。菌株HX6诱导组3种酶活性峰值均明显高于菌株GIM1.7与菌株HX2诱导组,菌株GIM1.7的3种酶活性均值大多稍高于菌株HX2诱导组。菌株HX6的不同浓度诱导试验表明,广藿香对较高浓度的青枯菌更为敏感,表现为中高浓度青枯菌诱导组酶活性增加的速度快而且达到峰值也更高。但随着时间的延长,植株发病严重,受损的细胞酶活性下降。表明青枯菌入侵能诱导寄主POD、PPO及PAL酶的升高,从而在一定程度上降低或延缓青枯菌的危害。7青枯菌诱导的广藿香防御相关酶同工酶分析以广藿香青枯菌菌株HX6、HX2及番茄青枯菌菌株GIM1.7为供试菌株,对广藿香进行侵染诱导试验,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,考察诱导植株1-7d内POD、PPO及SOD同工酶酶谱的变化。不同青枯菌菌株诱导的广藿香POD、PPO和SOD同工酶谱带与对照相比,在数目或强度上均有所增加;在诱导期内,相关酶带呈动态变化,不同青枯菌菌株诱导的酶带出现的时间和表现强度有所不同。表明POD、PPO及SOD在广藿香抵抗青枯菌入侵时可能起较为重要的作用。
参考文献：
[1]. 烟草青枯病菌噬菌体分离鉴定及部分噬菌体基因组学研究[D]. 苏靖芳. 黑龙江八一农垦大学. 2017
[2]. 植物青枯菌遗传多样性及致病力分化研究[D]. 潘哲超. 中国农业科学院. 2010
[3]. Ralstonia sp.Strain U2和Pseudomonas sp.WBC-3系列菌的趋化性研究[D]. 辛玉峰. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）. 2004
[4]. 3，5，6-叁氯-2-吡啶醇降解菌Ralstonia sp.strain T6的分离与鉴定及降解特性和降解机制研究[D]. 李静泉. 南京农业大学. 2012
[5]. 皮氏罗尔斯顿菌对香蕉假茎脱胶研究[J]. 胡佳丹, 张玉苍, 林昭华, 华美云, 邓叁喜. 食品科技. 2017
[6]. 烟田土壤青枯菌的分子检测技术及应用[D]. 种斌. 河南农业大学. 2010
[7]. 青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）致病性差异及其相关基因的分析[D]. 林海云. 福建农林大学. 2012
[8]. 花生抗青枯病分子机理初步解析[D]. 张冲. 福建农林大学. 2013
[9]. Genome sequence of Ralstonia solanacearum species complex phylotype Ⅰ strain RSCM isolated from Cucurbita maxima[C]. She, Xiaoman, Lan, Guobing, Yu, Lin, Tang, Yafei, Li, Zhenggang. 中国植物病理学会2018年学术年会论文集. 2018
[10]. 青枯菌侵染广藿香的致病过程及诱导寄主抗病性研究[D]. 徐燃. 广州中医药大学. 2013
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