重组牛肠激酶的克隆表达、纯化与活性测定方法研究

论文摘要

牛肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶,因为具有较强的特异性和较宽的活性范围,而在基因工程中得到广泛应用,对蛋白药物的研发也起着重要作用。本论文构建牛肠激酶轻链大肠杆菌表达菌株后发酵生产,经过多步纯化后得到重组牛肠激酶轻链蛋白,并对其酶比活性测定方法进行了研究。构建表达质粒pET39b-BEK,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中,经筛选鉴定得到阳性工程菌株后,发酵培养并诱导表达。每10 L发酵液能得到约250 g湿菌体,经电泳检测,目的蛋白主要出现在包涵体中。破碎菌体后收集包涵体,取5 g湿包涵体进行复性,并用亲和层析、分子排阻层析和阴离子交换层析等方法纯化蛋白。最终得到约220mg目的蛋白,即折合每升发酵液可得到纯化后的目的蛋白220mg左右。对纯化后的目的蛋白进行检测,蛋白含量约0.92mg/mL,纯度大于95%,酶比活性约为55000U/mg。分别使用两步法和荧光底物法检测纯化产品酶比活性。发现两步法操作繁琐,结果不精确,而荧光底物法操作简单,结果较佳,因此选择荧光底物法作为目的蛋白酶比活性检测方法。优化的荧光底物法反应条件为孵育温度25℃、缓冲液pH值8.0,并对荧光底物法进行了方法学验证,证明此方法稳定可靠。又对比了荧光底物法与以公司自制融合蛋白为底物的电泳法,建立了荧光底物法表示的酶比活性与电泳法表示的酶比活性的联系,使得用荧光底物法检测酶比活性的重组牛肠激酶轻链蛋白可用于融合蛋白的酶切。

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缩略词表

1.绪论

1.1.肠激酶简介

1.1.1.肠激酶的结构特点

1.1.2.肠激酶的酶学特点

1.1.3.肠激酶的生理功能

1.1.4.肠激酶的基因工程研究进展

1.1.5.肠激酶活性检测方法概述

1.2.选题意义及研究内容

2.重组表达菌株的构建

2.1.引言

2.2.实验材料及实验设备

2.2.1.菌种及载体

2.2.2.试剂耗材

2.2.3.主要仪器及型号

2.2.4.溶液配制

2.3.实验方法

2.3.1.基因克隆及表达载体构建

2.3.2.感受态细胞制备与质粒转化

2.3.3.阳性克隆筛选与鉴定

2.4.结果与讨论

2.4.1.RNA提取质量分析

2.4.2.逆转录PCR产物电泳结果

2.4.3.阳性克隆菌株鉴定

2.5.总结

3.牛肠激酶轻链蛋白的表达与纯化

3.1.引言

3.2.实验材料及实验设备

3.2.1.菌种

3.2.2.试剂耗材

3.2.3.主要仪器及型号

3.2.4.实验溶液配制

3.3.实验方法

3.3.1.发酵表达工艺

3.3.2.纯化工艺

3.3.3.纯化产品检测

3.4.结果与讨论

3.4.1.蛋白的发酵表达

3.4.2.蛋白的复性与纯化

3.4.3.纯化结果

3.5.总结

4.活性检测方法研究

4.1.引言

4.2.实验材料及实验设备

4.2.1.试剂耗材

4.2.2.主要仪器及型号

4.2.3.实验溶液配制

4.3.实验方法

4.3.1.基于胰蛋白酶原和BAEE的方法

4.3.2.基于荧光底物的方法

4.3.3.荧光底物法反应条件筛选

4.3.4.荧光底物法方法学验证

4.4.结果与讨论

4.4.1.BAEE法结果

4.4.2.荧光底物法结果

4.4.3.荧光底物法反应条件筛选结果

4.4.4.荧光底物法方法学验证结果

4.4.5.电泳法结果

4.4.6.总结

5.结论

参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张弨

导师: 梅乐和

关键词: 牛肠激酶轻链,重组表达,纯化,酶比活性

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江大学

分类号: Q55

DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.000750

总页数: 62

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