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牛Nebovirus的分子检测和基因组研究

2020-12-10阅读(406)

牛Nebovirus的分子检测和基因组研究

论文摘要

Newbury-1 virus目前是杯状病毒科（Caliciviridae family）纽布病毒属（Nebovirus genus）唯一成员,常用Nebovirus（NeV）表述。NeV为单股正链RNA病毒,是致犊牛腹泻的病毒。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出,具有广泛的地域分布。根据RdRp基因序列,NeV可以分为NB-like、NA1-like和Dijon A216-like 3种基因型;根据完整VP1序列,NeV可以分为2种基因型（基因1型和基因2型）,其中基因1型又细分为4个谱系（谱系14）。目前,NeV在我国的存在及流行情况尚不清楚。本研究旨在调查NeV在我国的流行情况及其分子特征,取得了以下成果:1.我国部分地区奶牛NeV的分子检测和基因组研究采集新疆维吾尔自治区、四川省、辽宁省、河南省、山东省和陕西省23个养殖场的307份奶牛粪便样本（237份腹泻粪便样本,70份临床健康粪便样本）,采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV在腹泻粪便样本的检出率（48.1%）显著高于健康粪便样本（5.70%,P<0.001）,场阳性率为95.7%。6个省40株奶牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为91.8%100%,与Gen Bank中所有NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为75.6%90.0%。遗传进化分析显示,我国奶牛NeV毒株与NB-like毒株的遗传关系最近,但共同聚为独立的一大支,显示有共同的进化趋势。5个省28株奶牛NeV完整VP1之间的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为69.0%100%和73.2%100%,与Gen Bank中所有NeV VP1的核苷酸相似性和氨基酸的相似性分别为65.5%94.7%和69.9%98.7%。遗传进化分析显示,27株NeV毒株属于基因型1（21株为谱系1、4株为谱系3和2株为谱系4）,剩余1株NeV毒株属于基因型2,表明我国奶牛NeV的VP1具有丰富的遗传多样性。成功获得Bo/LZB-1/CH/17毒株（基因2型）和Bo/YLA-2/17/CH毒株（基因1型谱系3）的完整基因组,其基因组大小均为7,453 bp。这2株NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为88.9%,与已知的4株NeV基因组的核苷酸相似性为79.4%87.5%。基于P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro和RdRp蛋白的遗传进化分析表明,Bo/LZB-1/CH/17毒株和Bo/YLA-2/17/CH毒株遗传关系最近,但这2株NeV的VP1遗传关系很远（Bo/LZB-1/CH/17毒株VP1属于基因2型,而Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1属于基因1型谱系3）。重组分析揭示Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1的P1A发生了重组事件,Bo/LZB-1/CH/17毒株RdRp的3’端发生了重组事件。本研究首次证实NeV在我国的存在并在奶牛中广泛流行,显示出独特的进化特征,为我国奶牛腹泻的诊断和防控提供了重要参考。首次获得VP1基因2型和基因1型谱系3的基因组,并首次鉴定NeV的VP1 P1A区域和RdRp 3’端的重组事件,对深入了解NeV的分子特征和遗传进化有重要意义。2.牦牛NeV的分子检测和基因组研究采集西藏自治区、四川省和云南省55个牧场的354份牦牛腹泻粪便样本,采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV的检出率为22.0%,场阳性率为69.1%。3个地区78株牦牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为63.1%100%,与Gen Bank中NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为62.4%97.2%。遗传进化分析显示,69株牦牛NeV毒株与我国奶牛中NeV毒株遗传关系最近,均为NB-like基因型;剩余9株牦牛NeV毒株共同聚为独立的一大支,区别于已知的NeV RdRp基因型,可能代表一种RdRp新基因型,建议命名为SC-Yak。2株具有潜在新RdRp基因型的NeV毒株（YAK/NRG-17/17/CH和YAK/HY1-2/18/CH毒株）的完整基因组被成功测序,其基因组大小分别为7,459 bp和7,460 bp,其5’-UTR分别为78bp和79 bp,3’-UTR均是66 bp。这2株牦牛NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为90.2%,与Gen Bank中所有6个NeV基因组的核苷酸相似性仅为68.1%69.3%。分析其VP1序列也表明这2株牦牛NeV的VP1可能代表一种VP1新基因型,建议命名为基因3型。基于基因组、VP1、RdRp、VP2、P34、NTPase、P30、VPg和3CLpro蛋白的遗传进化分析均显示,YAK/NRG-17/17/CH毒株和YAK/HY1-2/18/CH毒株共同聚为独立的一个大支,代表一种新型NeV毒株。有趣的是,基于VP1和RdRp序列,从四川省红原县和若尔盖县的6个牧场中检测到9株（11.5%）具有RdRp新基因型和VP1新基因型的NeV毒株,表明这种新型NeV已在当地牧场中流行。本研究首次证实了NeV在牦牛中存在并广泛流行,为牦牛腹泻疾病提供重要参考。在牦牛中鉴定了一种具有RdRp新基因型和VP1新基因型的NeV毒株,并获得了2株完整基因组,有助于了解NeV的遗传多样性。3.检测NeV的real-time RT-PCR方法的建立NeV RdRp 3’端序列是分子检测靶点,本研究前期发现国内NeV RdRp有独特的进化趋势;与国外NeV毒株相比,国内RdRp 3’端序列存在不同程度的点突变,有可能会影响RT-PCR方法对NeV的检出率。本研究的目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据本研究前期扩增的RdRp序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立了基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。该方法在2.9×1012.9×109 copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.9994,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,对常见无关病原不检出;最低检测下限为29 copies/μL;批内和批间的变异系数分别为0.89%1.89%和0.83%1.15%。检出率比较实验表明,该方法对45份奶犊牛腹泻样本NeV的检出率（68.8%）显著高于国外文献报道的SYBR Green real-time RT-PCR（28.8%）、巢氏RT-PCR（44.4%）和常规RT-PCR方法（13.3%）;该方法检出的阳性样本包括其它3种RT-PCR方法检出的阳性,且全部阳性经测序证实均为NeV。该方法具有特异性和稳定性好,灵敏度高的特点,为NeV的检测和流行病学调查提供了可靠的手段。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 Nebovirus的研究进展
  •   1.1 Nebovirus的发现及分类
  •   1.2 Nebovirus致病性
  •   1.3 Nebovirus的基因组结构和编码蛋白
  •   1.4 RdRp的分子特征及功能
  •     1.4.1 RdRp的分子特征
  •     1.4.2 RdRp的结构与功能
  •   1.5 VP1 的分子特征及功能
  •     1.5.1 VP1 的分子特征
  •     1.5.2 VP1 的结构与功能
  •   1.6 Nebovirus的检测技术
  •     1.6.1 电镜观察
  •     1.6.2 RT-PCR检测
  •     1.6.3 基于酶联免疫吸附试验的抗体检测技术
  •   1.7 Nebovirus的流行现状
  •   1.8 问题与展望
  • 第2章 我国部分地区奶牛Nebovirus的分子检测和基因组研究
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 临床样本
  •     2.1.2 主要试剂和仪器
  •     2.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
  •     2.1.4 RT-PCR检测Nebovirus
  •     2.1.5 与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
  •     2.1.6 Nebovirus完整VP1和Rd Rp基因片段的克隆
  •     2.1.7 Nebovirus完整基因组的克隆
  •     2.1.8 基因序列分析、遗传进化和重组分析
  •     2.1.9 统计分析
  •   2.2 结果
  •     2.2.1 Nebovirus RT-PCR检测结果
  •     2.2.2 Nebovirus与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
  •     2.2.3 RdRp基因片段序列分析、遗传进化及重组分析
  •     2.2.4 完整VP1 基因序列、遗传进化及重组分析
  •     2.2.5 2 株奶牛Nebovirus完整基因组序列分析、遗传进化及重组分析
  •   2.3 讨论
  •     2.3.1 我国奶牛Nebovirus的流行情况
  •     2.3.2 我国奶牛Nebovirus RdRp分子特征
  •     2.3.3 Nebovirus VP1 的基因型和谱系
  •     2.3.4 我国奶牛Nebovirus VP1 分子特征
  •     2.3.5 我国奶牛Nebovirus基因组特征
  •   2.4 小结
  • 第3章 牦牛Nebovirus分子检测和基因组研究
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 临床样本
  •     3.1.2 主要试剂与仪器
  •     3.1.3 病毒RNA的提取及cDNA的合成
  •     3.1.4 RT-PCR检测牦牛Nebovirus
  •     3.1.5 与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
  •     3.1.6 牦牛Nebovirus完整基因组的克隆
  •     3.1.7 RT-PCR方法筛选新型Nebovirus
  •     3.1.8 基因序列分析、遗传进化和重组分析
  •   3.2 结果
  •     3.2.1 牦牛Nebovirus的 RT-PCR检测结果
  •     3.2.2 Nebovirus与轮状病毒、冠状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染
  •     3.2.3 牦牛Nebovirus RdRp序列和遗传进化分析
  •     3.2.4 2 株牦牛Nebovirus基因组的特征
  •     3.2.5 牦牛腹泻样本中新型Nebovirus的 RT-PCR检测结果
  •   3.3 讨论
  •     3.3.1 牦牛Nebovirus的流行情况
  •     3.3.2 新型Nebovirus的基因组特征
  •     3.3.3 VP1 新基因型的特征
  •     3.3.4 RdRp新基因型的特征
  •     3.3.5 新型Nebovirus的流行情况
  •   3.4 小结
  • 第4章 检测Nebovirus的 Real-time RT-PCR方法的建立
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 病毒（菌）株核酸和临床样本
  •     4.1.2 主要试剂及仪器
  •     4.1.3 引物的设计与合成
  •     4.1.4 核酸提取
  •     4.1.5 阳性标准品的制备
  •     4.1.6 反应体系及条件的优化
  •     4.1.7 熔解曲线分析和标准曲线的建立
  •     4.1.8 特异性评价
  •     4.1.9 敏感性测定
  •     4.1.10 稳定性评价
  •     4.1.11 4 种RT-PCR对临床样本中NeV核酸检出率的比较
  •   4.2 结果
  •     4.2.1 引物的特异性
  •     4.2.2 优化的real-time RT-PCR反应体系及条件
  •     4.2.3 标准曲线及熔解曲线
  •     4.2.4 方法的特异性
  •     4.2.5 方法的敏感性
  •     4.2.6 方法的稳定性
  •     4.2.7 4 种方法对临床样本的复核率
  •   4.3 讨论
  •   4.4 小结
  • 结论与创新点
  • 参考文献
  • 附录一
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郭紫晶

    导师: 岳华

    关键词: 奶牛,牦牛,分子检测,基因组

    来源: 西南民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西南民族大学

    基金: “十三五”国家重点研发计划-牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究(2016YFD0500907),四川省应用基础项目:青藏高原牛羊重大疫病现场荧光PCR诊断技术的研究和应用(2017JY0066),四川省肉牛创新团队——现代繁殖技术研究与示范岗位团队

    分类号: S852.653

    DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000126

    总页数: 88

    文件大小: 3210K

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