论文摘要
局域表面等离子体共振（Local surface plasmon resonance,LSPR）是一种前沿的光学生物传感技术,与光学表面等离子体共振（Surface plasmon resonance,SPR）生物传感技术相比,在技术实现方面更具优势,同时又保留了 SPR高灵敏度、高选择性和无需标记特点。植物激素在植物生长发育过程中起着重要的调节作用,其中脱落酸（Abscisic acid,ABA）因其能够增强植物的抗逆性是研究最多的植物激素之一。传统的植物激素检测方法（如免疫分析法、色谱法及色谱-质谱联用技术）在样品前处理、仪器成本和技术人员操作要求等方面存在一定局限性。随着植物激素作用机理及信号转导等前沿学科的兴起,迫切需要实现植物激素ABA高特异性和高灵敏度检测。本论文采用LSPR光谱技术开展植物激素ABA定量检测及分析。利用金纳米颗粒LSPR特性,在植物激素ABA光谱信号获取、LSPR光谱系统构建、ABA特异性识别单元优化、光谱特征值提取、定量分析模型及方法对比等方面开展了一系列深入的研究。探讨了核酸适配体作为特异性识别单元的LSPR光谱对植物激素ABA快速和高灵敏检测,提出了一些新型高效的植物激素ABA定量分析方法,为植物激素的测定提供了一种新思路。主要研究内容如下:（1）针对传统植物激素ABA检测方法中存在的问题,研究采用通过紫外-可见分光光度计获取LSPR光谱信号,建立了植物激素ABA低成本LSPR光谱检测新方法。利用核酸适配体与金纳米颗粒之间配位键作用修饰金纳米颗粒,从而制备得到官能团化的金纳米探针,验证了该探针的团聚程度与植物激素ABA浓度密切相关。研究了 NaCl浓度、核酸适配体浓度、孵育时间对检测灵敏度的影响,并根据LSPR光谱中的特征吸光度比值（A620/A520）进行建模,建立了定量分析植物激素ABA模型。在优化实验条件下,当ABA检测浓度在5～20 μM范围时,吸光度比值（A620/A520）与ABA浓度的对数之间线性关系较好,线性相关系数为0.992,检测限为0.33 μM。同时考察了该方法的特异性,实验结果表明该方法对ABA检测表现出了较高的特异性。为了进一步验证该方法对实际样品检测的可行性,进行了植物样品水稻叶片中ABA检测,并与酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）相比较,得到的最大测量误差为7.93%,表明两种方法具有可比性。LSPR光谱信号通过紫外-可见分光光度计获取,方法简单且成本较低,并为接下来进一步构建LSPR光谱信号快速获取装置实现ABA快速、高灵敏检测奠定了基础;（2）采用紫外-可见分光光度计获取LSPR光谱信号时,光谱数据采集速度较慢,并且只有两个通道,无法同时进行多个样品的平行测定,造成植物激素ABA分析时间较长。为了提高LSPR光谱信号的获取速度,在对现有的LSPR光谱信号获取方式研究的基础上,构建了一套基于透射光谱检测方式的多通道LSPR光谱检测系统,并通过实验验证了该系统具有较好稳定性、重复性和通道间一致性。采用该系统进行了不同粒径的球形金纳米颗粒吸收光谱实验,在数据处理方面,采用Savitzky-Golay平滑算法对原始光谱数据进行预处理,并通过多项式拟合获得了精确的LSPR峰值波长,研究了金纳米颗粒粒径大小、介质环境折射率与共振波长之间的关系。实验结果证明:在相同介质条件下,随着粒径的增大,共振波长发生红移,且粒径大小与共振波长具有较好的线性关系;在相同粒径条件下,共振波长与介质环境折射率密切相关,对于粒径为25.5 nm和41 nm两种粒径的金纳米颗粒,介质环境折射率与共振波长具有较好的线性关系,折射率灵敏度分别为59.46 nm/RIU和70.38 nm/RIU。该系统能够实现LSPR光谱信号的快速获取及高通量检测,为进一步开展ABA的快速定量检测提供了一套新的LSPR生物传感分析系统;（3）为了提高ABA检测速度和检测灵敏度,采用构建的多通道LSPR光谱系统获取检测信号,并利用核酸适配体和ABA之间的特异性识别能力及金纳米颗粒的催化能力进行定量分析。为了提高核酸适配体与ABA之间的特异性,首先对核酸适配体序列进行了优化,在获得优化序列基础上,进一步提出了采用PolyA尾化的核酸适配体作为特异性识别单元,利用PolyA尾化的核酸适配体修饰小粒径金纳米颗粒,金纳米颗粒表面包裹的PolyA尾化的核酸适配体的数量与ABA浓度密切相关,即不同浓度的ABA造成金纳米颗粒表面裸露程度不同,通过添加还原剂NH2OH和生长剂HAuCl4诱导PolyA尾化的核酸适配体-金纳米颗粒探针进行生长。根据金纳米颗粒表面裸露程度不同,从而产生颜色和形貌不同的大粒径金纳米颗粒。研究了生长时间、生长剂用量、碱基A添加位置、个数、PolyA尾化的核酸适配体浓度对检测灵敏度的影响,并根据LSPR光谱峰值波长变化值（△Amax）建立了 ABA浓度定量分析模型。检测范围为0.1 nM～1 mM,并且在1nM～10 μM检测范围内△λmax与ABA浓度的对数具有较好的线性关系,线性相关系数为0.992,检测限为1 nM。此外,该方法对植物激素干扰物如赤霉素（GA3）和吲哚乙酸（IAA）表现出很小的响应,证明了该方法具有较好的特异性。与盐诱导金纳米颗粒团聚方法相比,检测灵敏度得到了提高,而且多通道LSPR光谱检测系统能够快速获取光谱信号和进行高通量检测。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 王顺
导师: 胡建东
关键词: 局域表面等离子体共振,金纳米颗粒,光谱信号获取,多通道,植物激素脱落酸,核酸适配体,定量分析
来源: 河南农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 河南农业大学
基金: 国家自然科学基金项目 “核酸适配体金纳米颗粒光学局域表面等离子共振小麦内源激素检测新方法研究(31671581)”,河南省自然科学基金(162300410143),省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室基金(SKL2014ZH-06,39990026)
分类号: O657.3;Q946.885
DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000155
总页数: 106
文件大小: 10769K
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