产褐藻胶裂解酶菌株HB172198的分类鉴定及产酶相关基因分析

论文摘要

褐藻胶是一种来源于褐藻细胞壁及细胞间质的水溶性酸性多糖,广泛分布于海带、马尾藻、巨藻等褐藻中。褐藻胶裂解酶能以β-消除方式催化降解褐藻胶,其降解产物—褐藻寡糖因具有众多生物活性被应用于农业、医药、化妆品等领域。但目前由于菌株产酶能力低,不适合工业化生产,制约了其广泛应用。本文从海洋生境中筛选高产褐藻胶裂解酶菌株,优化菌株产酶能力,并对菌株的遗传信息和产酶相关基因进行了生物信息学分析。具体研究结果如下:从海南岛沿海广泛采集海藻样品,采用两种样品处理方法,以海藻酸钠为唯一碳源培养基,筛选获得产褐藻胶裂解酶菌株共15株,分布于Cobetia、Isoptericola、Mangrovicoccus、Microbulbifer、Paenibacillus、Paracoccus、Vibrio等7个属。基于 16S rDNA 序列测定,菌株 HB172198 与 lemnae L7-75T 相似度最高,为97.63%,在发育树上聚为同一分支,亲缘关系最近。基于形态学与生理生化特征、16S rDNA系统发育分析和ANI分析,鉴定菌株HB172198为类芽孢杆菌的新种,命名为Paenibacillus algicola sp.nov.（海藻类芽孢杆菌）。以褐藻胶裂解酶酶活力为指标,利用响应面法对活性菌株HB172198培养基与培养条件进行了发酵优化。最佳发酵培养基与条件为:海藻酸钠7.50 g/L、胰蛋白胨13.57 g/L、NaC129.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.08 g/L,初始pH 7.0,在30℃、180 r/min培养36 h时,酶活力可达15.20 U/mL,是初始培养条件下酶活力的1.95倍。对经硫酸铵沉淀和离子透析后的粗酶液进行了酶学性质研究:酶的最适反应温度50℃,最适pH值7.0,在pH5.0～9.0及低于40℃的环境下比较稳定。Ca2+、Mg2+和Fe2+等离子对褐藻胶裂解酶有促进作用,EDTA、Ba2+、Zn2+等有抑制作用。利用TLC法对酶解海藻酸钠的寡糖组分进行初步鉴定,寡糖聚合度在1～6之间。对菌株HB172198采用PacBio RSII和Illumina X10测序平台测序,获得长度为4,475,055 bp、GC含量51.2%的基因组完成图。采用HGAP软件进行组装,通过软件glimmer 3.02、tRNA-scan、RNAmmer进行基因预测,预测到4210个基因,80个tRNA序列以及27个rRNA序列。对基因进行了 COG、KEEG数据库功能分类,共有2950个蛋白具有明确的生物学功能,1842个蛋白具有KEGG的同源基因,2946个蛋白具有COG分类。基于CAZY数据库对PL家族进行预测,预测出3个褐藻胶裂解酶序列,分别属于PL5、PL7和PL15家族。并通过氨基酸序列比对进行保守区域比较,根据生物信息分析预测出实验菌株可能的褐藻胶代谢途径。利用常温室压等离子体（ARTP）诱变技术对类芽孢杆菌HB172198进行诱变处理,筛选获得2株酶活明显增高及2株酶活明显降低的菌株。基于对4株菌的基因组重测序,明确了其序列差异。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 褐藻胶及褐藻胶裂解酶

1.1.1 褐藻胶与褐藻寡糖简介

1.1.2 褐藻胶裂解酶的分类

1.1.3 褐藻胶裂解酶的应用前景

1.2 产褐藻胶裂解酶微生物

1.3 多相分类学技术

1.3.1 细菌分类学的发展历史

1.3.2 多相分类技术概述

1.4 微生物基因组学

1.4.1 微生物基因组学发展历史

1.4.2 微生物基因组学研究内容

1.4.3 褐藻胶降解菌代谢途径研究进展

1.5 本课题研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要药品和试剂

2.1.2 主要仪器与设备

2.1.3 培养基

2.1.4 生物量和酶活测定

2.2 产褐藻胶裂解酶菌株分离及HB172198的多相分类鉴定

2.2.1 产褐藻胶裂解酶菌株的分离及保藏

2.2.2 产酶菌株HB172198的多相分类鉴定

2.3 菌株HB172198产褐藻胶裂解酶发酵优化及酶学性质研究

2.3.1 产酶发酵培养基优化

2.3.2 产酶发酵培养条件优化

2.3.3 酶学性质研究

2.4 菌株HB172198酶相关基因分析及突变株比较基因组分析

2.4.1 基因预测与功能注释

2.4.2 CAZyme家族分类预测及分析方法

2.4.3 等离子体诱变

2.4.4 比较基因组测序及分析

3 结果与分析

3.1 产褐藻胶裂解酶菌株的分离与筛选

3.2 菌株HB172198的多相分类鉴定

3.2.1 形态特征测定

3.2.2 生理生化特征

3.2.3 化学特征

3.2.4 分子特征

3.2.5 鉴定结果与种的描述

3.3 菌株HB172198产褐藻胶裂解酶发酵优化酶学性质研究

3.3.1 产酶培养基优化

3.3.2 培养条件优化

3.3.3 酶学性质研究

3.4 菌株HB172198的基因组特征与褐藻胶代谢调控相关基因分析

3.4.1 基因预测与功能注释

3.4.2 褐藻胶裂解酶CAZyme家族分类预测与分析

3.4.3 菌株HB172198褐藻胶代谢途径的预测

3.4.4 ARTP突变株的筛选

3.4.5 突变株的比较基因组分析

4 讨论

4.1 褐藻胶裂解酶菌株的筛选

4.2 褐藻胶裂解酶

4.3 褐藻胶代谢通路相关基因分析

4.4 等离子体诱变

5 结论

参考文献

附录

个人简介

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑志国

导师: 鲍时翔

关键词: 类芽孢杆菌,多相分类,响应面法,褐藻胶裂解酶,基因组学,诱变

来源: 海南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 海南大学

分类号: Q93

DOI: 10.27073/d.cnki.ghadu.2019.000427

总页数: 77

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产褐藻胶裂解酶菌株HB172198的分类鉴定及产酶相关基因分析

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