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裙带菜编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的cDNA克隆及其功能的初步研究

2020-12-08阅读(583)

裙带菜编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的cDNA克隆及其功能的初步研究

论文摘要

在自然界中,岩藻黄素占海藻中类胡萝卜素总产量的10%以上,具有多种生物活性。但是在褐藻中岩藻黄素的生物合成途径的多步反应尚不清楚,合成代谢途径中一些关键酶的编码基因研究也不多。本研究采用RT-PCR和5’/3’RACE的方法,从褐藻裙带菜（Undaria pinnatifida Suringar）组织中获得了编码ζ-胡萝卜素去饱和酶（ZDS）的cDNA,命名为UpZDS基因,该酶是催化链孢红素和番茄红素形成的关键酶。UpZDS基因全长的cDNA包含一个长度为1821 bp的开放式阅读框（ORF）,编码606个氨基酸残基组成的蛋白。生物信息学分析结果显示,在该蛋白N末端存在一个大小为51个氨基酸残基的叶绿体转运肽,氨基酸序列中存在甘氨酸富集区（Gly-rich sequence）,同时序列中还包含一个NAD/FAD结合域,同源性分析表明,UpZDS蛋白与其他植物的ZDS具有高度的保守性。本研究中将该开放阅读框克隆并连接到表达载体pET-28a（+）,构建重组表达质粒pET-28a-UpZDS,转化至E.coli BL21（DE3）构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达重组ζ-胡萝卜素去饱和酶。大肠杆菌的基因遗传互补实验结合高效液相色谱分析（HPLC）,验证了UpZDS基因所编码的蛋白具有ζ-胡萝卜素去饱和酶（ζ-carotene desaturase）的活性。同时表达UpZDS、crtE、crtB和crtP的大肠杆菌工程菌能产生链孢红素和番茄红素。此外,本实验中还考察了同时转化了crtE、crtB、crtP和UpZDS基因的大肠杆菌工程菌,在三个单因素条件下,产番茄红素、链孢红素和ζ-胡萝卜素这三种类胡萝卜素的情况。这三个单因素条件分别是不同的接种量,不同的IPTG浓度和不同的诱导温度。结果表明,在不同的接种量、不同的IPTG浓度和不同的温度下,大肠杆菌工程菌产三种类胡萝卜素情况始终是ζ-胡萝卜素最高,链孢红素第二,番茄红素最少。在接种量为唯一变量单因素实验中,番茄红素在接种量为1%时,其浓度达到最高,为0.637μg/mL。链孢红素和ζ-胡萝卜素在接种量为3%时,浓度达到最高,分别为2.182μg/mL和2.820μg/mL。在IPTG浓度为唯一变量的单因素实验中,番茄红素在IPTG浓度为0.5 mmol/L时达到最高值为0.691μg/mL。链孢红素和ζ-胡萝卜素均在IPTG浓度为0.7 mmol/L时达到最大值,分别为2.156μg/mL和2.392μg/mL。在温度为唯一变量的单因素实验中,番茄红素、链孢红素和ζ-胡萝卜素均在温度为20℃时,浓度达到最大值,分别为0.727μg/mL、2.301μg/mL和3.744μg/mL。本研究为阐明褐藻岩藻黄素的生物合成途径奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 引言
  • 第一章 裙带菜ζ-胡萝卜素去饱和酶cDNA的克隆
  •   1.1 实验材料
  •     1.1.1 实验藻株
  •     1.1.2 质粒、菌株及引物
  •     1.1.3 主要试剂
  •     1.1.4 主要仪器设备
  •     1.1.5 主要培养基和溶液的配制
  •   1.2 实验方法
  •     1.2.1 实验所用到的引物设计及基因测序
  •     1.2.2 质粒DNA的提取
  •     1.2.3 琼脂糖凝胶电泳
  •     1.2.4 PCR产物的回收和纯化
  •     1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
  •     1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化
  •     1.2.7 携带目的基因的克隆载体的构建
  •     1.2.8 质粒的PCR鉴定
  •     1.2.9 裙带菜总RNA提取
  •     1.2.10 c DNA第一链的制备
  •     1.2.11 UpZDS基因c DNA片段的克隆
  •     1.2.12 cDNA末端快速扩增（RACE）
  •     1.2.13 裙带菜ζ-胡萝卜素去饱和酶基因全长c DNA序列克隆
  •     1.2.14 生物信息学分析
  •   1.3 结果与分析
  •     1.3.1 裙带菜总RNA的提取
  •     1.3.2 基因克隆
  •     1.3.3 生物信息学分析
  •   1.4 讨论
  •   1.5 小结
  • 第二章 UpZDS基因在大肠杆菌中的表达及其功能验证
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 质粒、菌株
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器设备
  •     2.1.4 主要培养基配制
  •     2.1.5 主要溶液配制
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 DNA片段的酶切
  •     2.2.2 重组表达载体pET-28a-UpZDS的构建
  •     2.2.3 质粒的双酶切鉴定
  •     2.2.4 UpZDS基因的功能验证
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 重组表达载体pET-28a-UpZDS的构建
  •     2.3.2 UpZDS基因的表达及功能验证
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 不同条件对大肠杆菌工程菌中类胡萝卜素含量的影响
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验所需的工程菌
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要仪器设备
  •     3.1.4 主要培养基及溶液配制
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 工程菌基本培养条件
  •     3.2.2 类胡萝卜素的提取
  •     3.2.3 类胡萝卜素的测定
  •     3.2.4 链孢红素标准曲线的绘制
  •     3.2.5 ζ-胡萝卜素标准曲线的绘制
  •     3.2.6 不同的接种量对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •     3.2.7 不同的IPTG浓度对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •     3.2.8 不同的发酵温度对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 样品HPLC图谱
  •     3.3.2 不同的接种量体积对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •     3.3.3 不同的IPTG浓度对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •     3.3.4 不同的发酵温度对工程菌累积类胡萝卜素的影响
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 结论与展望
  •   4.1 研究总结
  •   4.2 创新点
  •   4.3 展望
  • 参考文献
  • 综述
  •   1.1 裙带菜概述
  •   1.2 类胡萝卜素的结构及分类
  •   1.3 类胡萝卜素的生物功能
  •     1.3.1 光合作用的辅助色素
  •     1.3.2 光保护作用
  •     1.3.3 抗氧化作用
  •     1.3.4 免疫功能
  •     1.3.5 抗肥胖功能
  •   1.4 类胡萝卜素的生物合成途径
  •   1.5 类胡萝卜素在动物生产中的应用
  •     1.5.1 在水产动物上的应用
  •     1.5.2 在禽类上的应用
  •     1.5.3 在其他动物上的应用
  •   1.6 研究的目的和意义
  •   综述参考文献
  • 攻读学位期间的研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 马怡

    导师: 李荣贵

    关键词: 裙带菜,胡萝卜素去饱和酶,类胡萝卜素

    来源: 青岛大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 青岛大学

    分类号: Q943.2

    DOI: 10.27262/d.cnki.gqdau.2019.001234

    总页数: 73

    文件大小: 4254K

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