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PBX1通过AKT/GSK3β/β-catenin轴促进毛囊间充质干细胞增殖和体细胞重编程

2020-12-02阅读(146)

PBX1通过AKT/GSK3β/β-catenin轴促进毛囊间充质干细胞增殖和体细胞重编程

论文摘要

目的:毛囊间充质干细胞（hHF-MSC）可通过直接拔取自体毛发分离获得,因此具备来源广泛,自体应用不存在免疫排斥等优势,同时利用Yamanaka因子可将毛囊间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）,使其具备向多种组织细胞分化的能力。尽管如此,体细胞重编成iPSC依然存在周期长效率低的问题,无法及时满足临床干细胞移植治疗的巨大需求,因而实现干细胞短期内的快速扩增并提高重编程效率将为干细胞组织工程的推广应用奠定良好的基础。方法与结果:本研究通过CCK8、流式细胞术检测PBX1对hHF-MSC增殖的影响;利用RT-qPCR、双荧光素酶报告基因检测PBX1在体细胞重编程期间对多能性基因的转录激活;利用western blot检测hHF-MSC在增殖和重编程过程中下游的蛋白变化,旨在探究PBX1促进hHF-MSC增殖和体细胞重编程的分子机制,研究结果如下（一）利用拔取毛囊进行贴壁培养成功分离CD44,CD73,CD90,CD105阳性细胞,这类成纤维样细胞具备成骨、成脂分化潜能,鉴定为hHF-MSC。（二）利用携带PBX1编码序列的慢病毒转导hHF-MSC,细胞增殖实验结果显示HF-MSC-PBX1组细胞增殖速率高于对照组,细胞周期结果显示PBX1加速G0/G1期细胞进入S期。过表达PBX1显著提高AKT及GSK3β磷酸化水平,加速β-catenin转运入核,并上调cyclinD1表达水平,抑制p16,p21表达。同时内源性PBX1能够引起细胞G0/G1期阻滞,并抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路。此外在PBX1过表达的情况下利用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理细胞能够逆转由PBX1介导的细胞增殖,上述实验提示PBX1通过AKT/GSK3β/β-catenin信号轴促进hHF-MSC增殖。（三）碱性磷酸酶（AP）染色结果显示利用PBX1联合Yamanaka因子转导hHF-MSC显著增加AP阳性克隆数,并且抑制内源性PBX1表达显著减少AP阳性克隆数。与Yamanaka因子相比,五因子重编程上调细胞内源性SOX2,OCT4,LIN28和NANOG的基因表达。双荧光素酶报告基因结果显示,PBX1在重编程期间显著上调NANOG启动子转录活性。Western blot结果显示,PBX1在重编程期间显著激活AKT/GSK3β/β-catenin信号轴,抑制p53,p21表达。此外由PBX1介导激活的NANOG可以进一步促进β-catenin的转运入核,并且由PBX1介导激活的AKT信号能进一步促进NANOG的表达。（四）在重编程早期,由PBX1介导的AKT/GSK3β活化可以减少因线粒体膜通透性改变所引起的细胞凋亡,并显著降低caspase3的表达及活性,减少其对PARP1的剪切。同时内源性PBX1敲低将加速p53介导的细胞凋亡。此外利用LY294002抑制AKT活性能够显著降低PBX1对重编程中间态细胞的保护作用,并降低体细胞重编程效率。结论:1.PBX1通过激活AKT/GSK3β/β-catenin轴促进hHF-MSC增殖。2.PBX1通过激活NANOG启动子及AKT/GSK3β/β-catenin轴上调体细胞重编程晚期NANOG的表达。3.PBX1通过激活AKT/GSK3β/β-catenin轴减少重编程早期由线粒体介导的细胞凋亡,并提高体细胞重编程效率。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 干细胞
  •     1.1.1 胚胎干细胞
  •     1.1.2 间充质干细胞
  •     1.1.3 衍生间充质干细胞
  •     1.1.4 毛囊间充质干细胞
  •     1.1.5 诱导多能干细胞
  •   1.2 重编程中的先锋转录因子及作用机制
  •     1.2.1 OCT4
  •     1.2.2 SOX2
  •     1.2.3 NANOG
  •     1.2.4 KLF4
  •   1.3 PBX1基因
  •     1.3.1 PBX1结构与功能
  •     1.3.2 PBX1与肿瘤
  •     1.3.3 PBX1的作用机制
  •     1.3.4 PBX1与干细胞
  •   1.4 AKT/GSK3β/β-catenin信号轴
  •     1.4.1 AKT
  •     1.4.2 GSK3
  •     1.4.3 β-catenin
  • 第二章 材料与实验方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 主要试剂
  •     2.1.2 主要耗材及仪器设备
  •     2.1.3 主要试剂配制
  •     2.1.4 实验动物
  •     2.1.6 实验细胞系
  •     2.1.7 质粒
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 hHF-MSC的分离培养
  •     2.2.2 免疫荧光染色鉴定表面标志
  •     2.2.3 流式细胞术鉴定表面标志
  •     2.2.4 hHF-MSC成骨诱导及检测
  •     2.2.5 hHF-MSC成脂诱导及检测
  •     2.2.6 RT-qPCR检测基因表达
  •     2.2.7 慢病毒包装
  •     2.2.8 细胞的病毒转导
  •     2.2.9 细胞活力检测
  •     2.2.10 细胞周期检测
  •     2.2.11 Western blot检测目的蛋白的表达
  •     2.2.12 诱导多能干细胞的建立
  •     2.2.13 iPSC的复苏、传代与冻存
  •     2.2.14 碱性磷酸酶染色
  •     2.2.15 畸胎瘤形成实验
  •     2.2.16 双荧光素酶报告基因检测
  •     2.2.17 流式细胞术检测细胞凋亡
  •     2.2.18 Caspase3活性检测
  •     2.2.19 统计学分析
  • 第三章 结果
  •   3.1 PBX1对毛囊间充质干细胞增殖的影响
  •     3.1.1 hHF-MSC的分离培养
  •     3.1.2 hHF-MSC表面标志鉴定
  •     3.1.3 hHF-MSC多向分化能力检测
  •     3.1.4 RT-qPCR和Western blot检测hHF-MSC中PBX1的表达
  •     3.1.5 建立PBX1过表达hHF-MSC
  •     3.1.6 过表达PBX1对hHF-MSC增殖的影响
  •     3.1.7 PBX1对hHF-MSC增殖相关蛋白的影响
  •     3.1.8 抑制内源性PBX1的表达对hHF-MSC增殖的影响
  •     3.1.9 LY294002抑制hHF-MSC-PBX1细胞的增殖
  •   3.2 PBX1对人毛囊间充质干细胞重编程的影响
  •     3.2.1 PBX1在重编程期间的表达
  •     3.2.2 SOMKP重编程hHF-MSC
  •     3.2.3 SOMKP-iPSC细胞表面标志鉴定
  •     3.2.4 SOMKP-iPSC多能性相关基因检测
  •     3.2.5 SOMKP-iPSC的畸胎瘤检测
  •     3.2.6 SOMKP-iPSC的核型检测
  •     3.2.7 PBX1促进hHF-MSC重编程为iPSC
  •   3.3 PBX1促进毛囊间充质干细胞重编程的相关机制研究
  •     3.3.1 PBX1激活多能性相关基因表达
  •     3.3.2 PBX1激活NANOG启动子
  •     3.3.3 PBX1在重编程期间激活AKT/GSK3β/β-catenin轴
  •     3.3.4 PBX1通过激活AKT/GSK3β/β-catenin轴促进hHF-MSC重编程
  •     3.3.5 PBX1在重编程早期抑制细胞凋亡
  •     3.3.6 抑制PBX1表达促进重编程期间细胞凋亡
  •     3.3.7 PBX1通过激活AKT抑制hHF-MSC重编程期间的细胞凋亡
  • 第四章 讨论
  •   4.1 PBX1对毛囊间充质干细胞增殖的影响
  •   4.2 PBX1对毛囊间充质干细胞重编程的影响
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 作者简介及在学期间所取得的研究成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 蒋亦旭

    导师: 刘晋宇

    关键词: 毛囊间充质干细胞,诱导多能干细胞,增殖,体细胞重编程

    来源: 吉林大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 吉林大学

    分类号: R329.2

    DOI: 10.27162/d.cnki.gjlin.2019.000266

    总页数: 111

    文件大小: 9679K

    下载量: 326

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