王万山[1]2004年在《人生长分化因子5的克隆、表达和诱导活性的初步研究》文中研究指明生长分化因子5(Growth differentiation factor 5，GDF5)是TGF-β超家族(Transforming growth factor-β superfamily,TGF-β)骨形态发生蛋白亚家族(bone morphogenetic proteins subfamily，BMPs)较特殊的一员，优势表达于关节软骨组织，它在软骨发生和长骨发育中具有重要作用，可促进体外培养间质祖细胞的软骨和骨生成活性，体内移植研究表明GDF5能异位诱导生成软骨和骨组织，而且主要诱导软骨样组织。为了进一步了解GDF5的生物学活性以及拓展其在骨和软骨组织工程中的应用，特进行了本实验。 本研究从人胎儿软骨组织中提取总RNA，利用RT-PCR的方法分别克隆了GDF5完整成熟肽和全长cDNA序列，并分别把两个序列克隆入原核表达载体pET22b(+)和真核表达载体pEGFP-C2，构建了重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5和重组真核表达载体pEGFP-C2-GDF5。原核重组子转化大肠杆菌BL-21(DE3)后用IPTG进行成熟肽的诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达蛋白的诱导动力学，Western bloting鉴定表达蛋白。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白，植入小鼠后肢股部肌袋内进行表达蛋白的生物学活性鉴定。同时分离培养人胎儿骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，流式细胞仪鉴定MSCs表面抗原。LipofectAMINE脂质体法转染重组子pEGFP-C2-GDF5入MSCs，观察转染细胞的生物学性状(形态学、生长增殖性能等)变化，免疫细胞化学、Western bloting及RT-PCR法检测目的蛋白和相关基质蛋白在mRNA和蛋白水平的表达，初步探讨GDF5基因转染对MSCs的诱导分化作用。 结果表明：成功构建了pET22b(+)-GDF5原核表达载体和pEGFP-C2-GDF5真核表达载体。SDS-PAGE电泳和Western bloting显人生长分化因子5(GDFS)的克隆、表达及诱导活性的初步研究示GDFS成熟肤在BL一21里得到表达，表达量占菌体总蛋白的13%，凝胶薄层扫描分析显示纯度达80%以上。异位诱骨实验在小鼠后肢肌袋内出现间质聚集和大量软骨及少量骨组织形成。流式细胞仪分析显示成功分离到均一性较高的人骨髓间充质干细胞，免疫细胞化学法和Westem bloting显示GDFS基因转染MSCs成功。形态学观察显示转染细胞在光镜水平除了多角形细胞多见外并没有明显改变，电镜下可见转染细胞结构细胞器丰富，分泌征象显着。转染对MSCs细胞增殖和生长周期没有影响。collagenn在mRNA和蛋白水平的表达说明了转染细胞和亲本细胞相比表型已发生改变，具备了软骨细胞的部分表型特征。ALPase染色阴性和ostcocalcin转录水平的检测阴性说明转染细胞未表现成骨细胞表型。综上，本实验在大肠杆菌中表达了有生物学活性的GDFS，成功转染MSCs并获得表达，转染后的MSCs具有向软骨细胞谱系方向分化的特性，提示其在软骨和骨组织工程中的潜在应用前景
吴迪[2]2012年在《猪HOXA10基因的表达调控研究及激素诱导型启动子转基因小鼠与猪的制备与鉴定》文中指出产仔数性状的改良可以为养猪业带来巨大的经济效益。研究影响产仔数性状的重要候选基因的功能并应用于育种实践的工作已引起育种工作者们越来越多的重视。利用转基因动物技术进行母猪产仔数性状的改良具有广阔的发展前景。同源异形框基因HOXA10是近年来受到广泛关注的产仔数性状重要候选基因之一。转录因子HOXA10对子宫内膜的分化发育和胚胎附植的建立以及正常妊娠的维持的调控都起到必不可少的关键作用,并且受到雌激素(E2)和孕激素(P4)的调节而对产仔数产生影响。然而,关于猪HOXA10基因的转录调控研究很少。鉴于HOXA10基因在胚胎附植过程中的重要功效,我们对猪HOXA10基因的表达和调控机理进行了初步研究,并制备了转HOXA10基因动物模型。本研究主要结果如下：1.克隆获得了猪HOXA10基因包含完整CDS区域的cDNA序列(1363bp)并分析了其基因组的结构。HOXA10基因含有两个外显子和一个内含子；cDNA全长2628bp; CDS长1236bp编码411个氨基酸,其氨基酸序列与人类和小鼠同源性分别达90%和95%,发现氨基酸序列中存在一个同源结构域；2.发现了2个猪HOXA10基因的SNP位点,其中一个位于第一外显子上。该外显子MslI多态位点的等位基因频率在国内外不同品种猪中的存在显着差异；性状关联分析结果显示,HOXA10基因SNP位点与母猪总产仔数显着相关,与产活仔数和初生重呈极显着相关；3. RT-PCR结果显示猪HOXA10基因在子宫内膜组织中高表达,同时在膀胱和肾脏组织中表达量也很高,这一结果与小鼠HOXA10基因组织表达模式一致；定量PCR结果表明,HOXA10基因在不同妊娠时期的梅山猪和大白猪子宫内膜中呈差异表达,其中,在两个品种的各个时期中,妊娠15天的梅山猪子宫内膜中HOXA10基因的表达量最高,并且极显着的高于大白猪妊娠15天的子宫内膜(P<0.01)；而在妊娠50天时,大白猪子宫内膜HOXA10基因的表达量极显着高于梅山猪(P<0.01)；另外大白猪品种内比较,妊娠50天时子宫内膜中HOXA10基因的表达最高；4. QPCR检测结果显示,腹腔注射2mg孕激素／天,可以显着增加妊娠第5天小鼠子宫内膜中HOXA10基因的表达水平,同时平均胚胎着床数增加1只；5.利用系列删除载体构建和荧光素酶报告基因活性检测的方法首次鉴定了位于猪HOXA10基因5'上游的一个激素诱导型启动子区域,该启动子区域受到E2的刺激后活性增强；构建HOXA10基因激素诱导型重组载体pc3.1-Pro3-DNA,并且在Ishikawa细胞中验证该重组载体受到E2和P4的诱导后可以上调HOXA10基因的表达；6.将pc3.1-Pro3-DNA重组载体线性化,利用显微注射法制备了转基因小鼠和转基因猪,并进行了PCR和Southern blot检测,结果共获得5只阳性首建鼠(F0),Southern blot检测出其中2只为阳性。这2只F0代转基因小鼠与野生型小鼠交配用于建系。经PCR和Southern blot检测,获得9只F1代阳性小鼠,阳性率达40.9%。PCR检测获得21只F2代阳性小鼠,阳性率达61.8%。其中对F2代阳性个体RT-PCR检测发现子宫内膜、肾脏和膀胱中均有外源HOXA10基因的表达。经PCR检测F1代和F2代的PCR鉴定结果表明,F0代鼠的转基因可稳定遗传给后代。另外,QPCR检测发现,妊娠第5天的阳性转基因小鼠子宫内膜中外源HOXA10基因的表达量显着高于正常发情第5天的阳性转基因小鼠,同时胚胎附植平均数比非妊娠的转基因小鼠多1只左右。显微注射法第一批共获得33头仔猪,通过PCR与Southern blot检测,得到4头阳性HOXA10转基因猪,阳性率为12.1%。
吴拥军[3]2009年在《ChIFN-γ基因的植物表达及其生物活性研究》文中进行了进一步梳理干扰素(IFN)作为一种动物细胞产生的细胞因子,具有广谱抗病毒活性和免疫保护作用。随着养鸡业集约化和商品化方向的发展,对病毒性疾病的有效预防与治疗,需要大量的干扰素。目前,IFN的生产主要以原核表达系统为主,后处理工艺繁琐,导致IFN活性低,生产成本高。而应用植物生物反应器生产IFN可以克服上述缺点,同时具有生产量大、可作为植物疫苗佐剂直接口服等优势。因此,研究IFN在植物中的表达特性及其生物学活性具有重要的理论价值和实践意义。研究利用GenBank数据库登录的ChIFN-γ基因序列,依据油菜密码子最高使用频率优化并设计了ChIFN-γ基因,人工合成长度614bp,包含有油菜Napin信号肽序列、Kozak序列和内质网滞留信号肽SEKDEL序列的ChIFN-γ融合基因。采用特异性引物,PCR扩增得到1158bp的Napin油菜种子特异性启动子。分析表明,Napin启动子中含有启动子基本元件及特异性元件ABREs和RY基序。应用同尾酶连接法构建了pSH-NGN、pSH-NGNL、pSH-IFNG植物表达载体用于遗传转化烟草和油菜。为了验证植物表达载体设计与构建是否正确,将含有质粒pSH-NGN、pSH-NGNL和pSH-IFNG的根癌农杆菌,以生菜为受体材料,采用真空渗透法进行瞬时表达研究。结果表明,叁种植物表达载体在生菜中瞬时表达ChIFN-γ蛋白的平均含量分别为675.7pg/g、665.7pg/g及519.5pg/g。为简化蛋白提取方法,降低目的蛋白降解速度,采用不同的蛋白缓冲液提取ChIFN-γ蛋白。ELISA检测结果显示,以组成为50mM PBS,pH7.5、1%SDS、0.25MNaCl、1%β-巯基乙醇和0.05%Tween-20的缓冲液提取目的蛋白的效率最高,每克叶片最高达到1.2μg。Western blot检测表明,表达的蛋白分子量大小约30kDa。将含有质粒pSH-IFNG和pSH-NGNL的根癌农杆菌EHA105遗传转化烟草,获得24株转ChIFN-γ基因烟草。经PCR、RT-PCR、GUS组织化学染色和ELISA检测表明,ChIFN-γ基因已整合到烟草的染色体中,并能正确转录与表达。ChIFN-γ蛋白在转基因烟草植株中的表达量最高达到20μg/g,高出已报道的转基因烟草表达外源基因的通常水平(0.000017%-0.001%)。经Western blot检测,目的蛋白为30kDa和40kDa,分析为糖基化程度不同所致。对转基因烟草T_0代完整生长期的农艺性状观察发现,除虫害较少、叶片粘性增加、花苞较小、种子籽粒数少及色泽稍浅外,其它性状与野生型差异不显着。将质粒pSH-IFNG、pSH-NGNL以根癌农杆菌介导法遗传转化油菜,筛选出25株转ChIFN-γ油菜。其中Napin启动子驱动表达的ChIFN-γ蛋白最高表达量达到58μg/g,比35S启动子驱动的转化植株总体平均高出2.64倍,最高达5.17倍。表明在油菜中由Napin启动子及其信号肽组成的ChIFN-γ基因的表达盒,ChIFN-γ蛋白表达量明显高于组成型启动子35S。Napin启动子的‘渗漏'现象与其含有启动子元件有关。以转ChIFN-γ基因烟草T_0代叶片粗提总蛋白进行鸡胚成纤维细胞病变试验确定ChIFN-γ的活性效价。鸡胚成纤维细胞培养约24h呈单层时,采刚VSV(TCID_(50)=10~(-5))病毒攻毒,在22h和42h时分别观察细胞形态,计算得到每毫克转基因烟草中ChIFN-γ蛋白效价为5.12x10~3U。机械摩擦法接种易感型TMV病毒,6天内,转基因烟草组对病毒抑制率为100%,随着时间延长抑制率平缓下降,16天后抑制率稳定在约32%,接毒植株的生长并未表现出受到抑制的现象。对照组一周后开始出现不同程度的花叶和枯斑,感染率达到95%。说明转ChIFN-γ基因烟草植株对TMV的浸染具有显着抑制作用。采用漂浮板快速育苗,获取大量的转基因植株叶片。将转基因烟草叶片匀浆后添加至饲料中,以每克饲料添加50U ChIFN-γ蛋白和每只鸡20g饲料/天的喂养量,分组隔离喂养1-10天后,采用NDV强毒株病毒进行攻毒,20天后捕杀。结果显示,ChIFN-γ蛋白具有增加雏鸡体重的作用;血清凝集试验显示,饲喂ChIFN-γ蛋白组NDV抗体效价高于对照组;喂食300UChIFN-γ蛋白对雏鸡的保护率可达80%。表明ChIFN-γ蛋白可通过口服喂养途径显著地提高鸡体抗病毒能力。自然接种烟草蚜虫和离体利用转基因烟叶饲喂野生斜纹夜蛾幼虫及烟青虫,转ChIFN-γ基因烟叶表现出显著的抗虫效果。通过测定烟草烟碱含量、饲喂烟叶后烟青虫蛋白酶活性变化、烟草中挥发性物质和对烟草组织进行切片染色观察。发现烟碱含量与对照无显著差异;12h时,饲喂转基因烟草组的虫体蛋白酶活性较对照组低5.4%;转基因烟草叶片增厚,细胞致密,细胞壁增厚,表皮腺毛数量增加可能是导致其抗虫的直接因素之一;转基因组与野生型烟草挥发性成分存在一定的差异,转基因烟草中黑松叁烯和西柏叁烯二醇含量的提高与其抗虫性直接相关,ChIFN-γ基因激活的多种转录因子可能结合了腺毛发育相关基因的cis调节元件,上调了腺毛发育基因的表达,导致腺毛的数量增加,分泌的萜烯化合物增加从而具有显着地抗虫性。综上所述,植物能表达出有生物活性的ChIFN-γ蛋白,转ChIFN-γ基因植物具有一定的抗动、植病毒和抗虫作用。研究为应用植物生物反应器生产ChIFN-γ蛋白及其开发和应用奠定了基础;同时,通过直接口服饲喂转基因植物方式,对禽类疾病的预防与治疗提供了新的方向。
冷怀明[4]2002年在《《第叁军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中研究指明外文字母、数字1 2 5Ｉ标记1 2 5Ｉ-ＲＧＤ - 4ＣＹ肿瘤αｖβ3受体显像的实验研究 (李前伟等 ) 2 4(1 1 ) :1 340 - 1 3421 甲基 4 苯基吡啶ＭＰＰ+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性的影响 (陈锦华等 ) 2
李宏昊[5]2008年在《兔生长激素的表达、纯化和鉴定》文中研究指明人生长激素作为一种蛋白质药物用于治疗生长激素缺乏等症在临床应用多年，关于生长激素适应症的研究始终没有间断。因此建立一个合适的动物模型对生长激素的应用研究至关重要。兔就是一种研究生长激素功能的较理想模型。因此，本文利用大肠杆菌表达、复性、纯化获得了兔成长激素并且对其进行了鉴定。从而首次获得了成熟兔生长激素。将插入兔生长激素基因片段的pET11a和pET32a融合型表达载体，分别转化到大肠杆菌中，经IPTG诱导，成功表达了融合蛋白MEAE-rabGH和Trx-D4KrabGH。两种融合蛋白均以包涵体的形式表达，表达水平分别为47mg/L·OD和122mg/L·OD。尝试低温培养和降低诱导IPTG浓度以期获得可溶性表达，但未获得预期结果。分离包涵体后，优化了包涵体的溶解条件和复性条件。用优化条件获得的复性蛋白经Q Sepharose Fast Flow初步纯化后，优化了蛋白酶切条件。用优化酶切条件酶切得到的产物经Sourse 30S精细纯化得到了纯度大于95%的成熟兔生长激素。Trx-D4K-rabGH策略和MEAE-rabGH策略的纯化收率分别为5.8%和8.9%。利用基质辅助激光电离解吸附-飞行时间质谱测定了兔生长激素完整蛋白分子量为21771Da，与理论值吻合。胰蛋白酶水解后，经质谱分析得到了兔生长激素胰蛋白酶切指纹图谱，分析确定了二硫键组合为Cys52-Cys163和Cys180-Cys188，与预期吻合。细胞学实验表明纯化的兔生长激素有活性。
周建大[6]2004年在《原代成体皮肤角质形成细胞、成纤维细胞的培养和转基因研究》文中研究指明目的:皮肤创伤修复的难点是修复细胞的快速增殖分化、生长因子的持续有序作用和细胞外基质支架的构建。依据现代分子生物学和组织工程学的研究进展,首先在体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子基因和人血管内皮生长因子基因真核表达质粒,用脂质体转染法将人表皮生长因子基因导入原代离体成人角质形成细胞,将血管内皮细胞生长因子基因导入原代离体成人皮肤成纤维细胞,分别证实转基因细胞表达和分泌hEGF和hVEGF的能力,以达到为皮肤创伤原位修复和人工皮肤构建研究中修复细胞快速增殖、生长因子稳定有序表达目的。方法:第一章:设计人表皮生长因子(hEGF)基因及其信号肽基因引物,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)从正常胚胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因及其信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,质粒抽提后经酶切鉴定和序列分析验证,随后两序列片段经T4连接酶连接后克隆入表达质粒pcDNA3.1(+),再次质粒抽提后经酶切鉴定和序列分析。第二章:采用两步酶消化法对取自成人腹部的全层皮肤组织进行消化,从表皮层中获取角质形成细胞,用无血清培养基Defined Keratinocyte-SFM(DKSFM)传代培养。后以脂质体转染法将质粒pcDNA3.1(+)/hEGF导入角质形成细胞,培养48小时后取细胞作RT-PCR、上清分别进行放射免疫测定和MTT实验。第叁章:设计人血管内皮生长因子(hVEGF121)基因引物,从正常胚胎肝组织总RNA中行RT-PCR扩增出hVEGF121基因序列,克隆入pGEM-T载体,质粒抽提后酶切鉴定,后将序列片段重新克隆入表达质粒pcDNA3.1(+),再次质粒抽提后酶切鉴定和序列分析。第四章:采用两步酶消化法从成人腹部皮肤真皮中获取成纤维细胞,以含15%胎牛血清DMEM培养基传代培养。后以脂质体转染法将pcDNA3.1(+)/hVEGF121导入成纤维细胞,转基因细胞培养48小时后取细胞作RT-PCR,上清分别行ELISA检测、MTT实验和Mile’s实验。结果:第一章:将RT-PCR扩增产物凝胶电泳分别获得约90 bp和180 bp
王崧[7]2013年在《新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究》文中研究指明随着社会的发展，由多种原因引起的血小板减症越来越常见。血小板由骨髓中的巨核细胞产生，通过对巨核细胞增殖分化进行调控，可有效促进血小板生成。因此，具有升血小板作用的造血生长因子类基因工程产品倍受推崇。然而，目前临床上用于救治血小板减少症的该类药物种类稀少，且存在着可能产生中和性抗体、副反应突出、价格昂贵等多种缺点，临床上迫切需要能够高效升血小板的新型药物。血小板生成素(thrombopoietin, TPO)，又称巨核细胞生长发育因子(megakaryocytegrowth and development factor, MGDF)，是调节巨核细胞生成和血小板产生最重要的细胞因子。通过与其受体(c-Mpl)结合，TPO能够激活巨核细胞中一系列的信号通路，发挥其促进巨核细胞增殖分化的功能。据此，人们尝试利用基因工程方法制备出重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)和聚乙二醇化重组人巨核细胞生长发育因子(pegylated recombinant human megakaryocyte growth and developmentfactor, PEG-rhMGDF)两种第一代促血小板生长因子类药物。但是，PEG-rhMGDF在临床试验中产生了能够与内源性TPO交叉反应的中和性抗体，美国FDA因此全面禁止了重组人TPO类基因工程产品的临床实验。TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)是通过噬菌体表面展示技术鉴定出的一种由14个氨基酸组成，与c-Mpl具有高亲和力，但与TPO序列完全不同源的短肽。实验表明，TMP不仅能够在体外有效促进巨核细胞增殖，且在动物体内未发现其能够诱导产生中和性TPO抗体。然而，TMP分子量太小，难以通过基因工程方法制备，且在循环中极易降解，限制了其应用。多项体内研究发现，人生长激素(human growth hormone, hGH)对造血干/巨核祖细胞增殖分化及促进血小板生成具有重要调控作用。hGH主要通过与其受体(growthhormone receptor, GHR)结合发挥其生物学活性，该受体与c-Mpl同为I类细胞因子受体，能够激活相似的增殖分化信号通路。因此，我们设想将TMP与hGH进行融合，一方面利用与生长激素进行融合，提高分子量，使得TMP能够通过基因工程方法进行制备，同时延长其体内半衰期。另一方面，通过融合发挥TMP与hGH在促进巨核细胞生成及血小板产生方面的协同作用。基于已有的研究基础，在国家“863”计划和新药创制科技重大专项课题的资助下，我们首先尝试通过巴斯德毕赤酵母表达系统对一个TMP分子与hGH的融合蛋白rTMP-GH进行了发酵表达及纯化制备。之后，为了提高融合蛋白的生物学活性，又设计了一种由两个串联的TMP分子(TMP二联体)与hGH组成的融合蛋白，并利用pMAL-p2x原核表达载体在大肠杆菌中进行可溶性表达与制备。在确认dTMP-GH具有显着促进巨核细胞生成活性的基础上，为了简化制备工艺、提高产量，进一步探索了在大肠杆菌中以温控诱导和包涵体表达方式生产制备dTMP-GH融合蛋白，通过工艺优化最终实现了该重组融合蛋白的高密度发酵表达及放大生产，获得了纯度大于98%，且具有高效促巨核细胞增殖分化活性的dTMP-GH融合蛋白基因工程产品。同时，从信号通路激活的角度对dTMP-GH融合蛋白促巨核细胞增殖分化的作用机制进行了探讨。所取得的主要研究结果与结论如下：1.通过基因重组成功构建了pPIC9K-rTMP-GH真核重组表达质粒，筛选出高G418抗性的His+/Mut+多克隆表达菌株，实现了rTMP-GH在巴斯德比赤酵母GS115中的高密度发酵表达。经超滤、阴离子柱及分子筛纯化，获得了纯度大于95%的rTMP-GH重组融合蛋白。经体外实验证实rTMP-GH具有一定的促进巨核细胞增殖活性。2.通过合理化设计酶切位点，成功构建了pMAL-dTMP-GH重组表达质粒。电转化大肠杆菌后，阳性克隆经IPTG诱导，获得可溶性融合蛋白MBP-dTMP-GH。通过亲和层析、Xa酶切、疏水株及分子筛再纯化，最终得到纯度达98.5%，且N端不含任何多余氨基酸的重组融合蛋白dTMP-GH。体外细胞实验证实，dTMP-GH能够以剂量依赖方式促进巨核祖细胞株M07e的增殖，其活性显着优于等摩尔剂量的rTMP-GH融合蛋白。3.利用温控原核表达载体pBV220，通过包涵体形式实现了dTMP-GH融合蛋白在大肠杆菌中的高密度发酵表达，表达水平约为500mg/L。建立了包括包涵体变性、复性、阳离子柱层析、阴离子柱层析及分子筛层析的纯化方案，获得了纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白，得率为20%。其生物学活性与采用大肠杆菌分泌性表达方式制备的dTMP-GH无显着性差异。4.体外实验证实，dTMP-GH促进早期巨核细胞增殖的活性较等摩尔剂量dTMP强，GH拮抗剂培维索孟预处理能够显着削弱dTMP-GH的促巨核细胞增殖活性，提示融合蛋白中的hGH具有增强dTMP促巨核细胞增殖分化的作用，而且这种增强作用可能通过巨核细胞表面的GHR介导发挥。5. Western blot分析结果表明， dTMP作用15min即可显着上调M07e细胞中STAT5和ERK1/2的磷酸化水平，1h左右磷酸化水平恢复正常，而rhGH却无明显促STAT5磷酸化作用，但在其作用1h后可出现ERK1/2的显着磷酸化，并可持续3h以上时间。提示rhGH可能通过缓慢而持续激活ERK1/2信号通路来增强dTMP诱导的巨核细胞增殖与分化。6.激光共聚焦及Western blot检测分析发现，rhGH处理能够显着上调成熟巨核细胞株Meg-01中肌动蛋白的表达，并能促进肌丝拉伸和细胞伪足伸出，提示rhGH具有促进巨核细胞分化成熟的作用。进一步研究发现，rhGH作用15min即可显着上调Meg-01中Akt的磷酸化水平，而dTMP对Akt无明显激活作用，提示rhGH可能通过激活Akt信号通路促进了巨核细胞的分化成熟。7. dTMP-GH融合蛋白可同时发挥dTMP与rhGH的生物学活性。在M07e中，dTMP-GH作用可同时上调STAT5和ERK1/2的磷酸化水平，且ERK1/2磷酸化可持续3h以上。给予GH拮抗剂培维索孟能够抑制dTMP-GH对ERK1/2信号通路的持续激活作用。在Meg-01中，dTMP-GH作用可显着上调Akt的磷酸化水平，且该作用能够被培维索孟显着抑制。8.对人脐血CD34+来源的原代巨核细胞的实验证明，dTMP-GH能够显着上调培养至7d原代巨核细胞STAT5和ERK1/2磷酸化水平，且ERK1/2磷酸化可持续至3h以上。并且dTMP-GH作用可显着激活培养至11d原代巨核细胞中的Akt信号通路。总之，本研究通过探索不同的表达体系、优化表达条件和纯化工艺，从而成功实现了一种TMP二联体与hGH的重组融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与制备，最终获得纯度大于98%的dTMP-GH融合蛋白。体外实验证实，dTMP-GH具有显着促进巨核细胞增殖分化活性，其中dTMP主要发挥促进巨核细胞早期增殖分化的作用，GH除了可以增强dTMP的促巨核细胞增殖活性外，还具有促进巨核细胞分化成熟的作用。因而，通过融合不仅间接增大了dTMP的分子量，使其可以通过基因工程方法进行制备，而且所形成融合蛋白还具有突出促巨核细胞增殖、分化和成熟的活性，显示出很好的开发应用前景。
张艳丽[8]2010年在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中指出人溶酶体β-葡萄糖苷酶(human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase)是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第叁、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因(Neor)插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第叁部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型(2n=58+XX)正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着(P>0.05)。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚(2-细胞期或以上)移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：叁种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞(P<0.05),其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高(P<0.05)；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因(IGF2, IGF2R)、凋亡相关基因(Bax)、应激相关基因(热休克蛋白,Hsp70.1)、细胞连接相关基因(Cx43)和DNA甲基化转移酶1基因(DNMT1)。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞(P<0.05)。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
任晓勇[9]2005年在《人生长分化因子-5基因转染骨髓间充质干细胞及用于软骨缺损修复的初步研究》文中研究指明创伤和疾病引起的头颈部软骨缺损的修复仍是耳鼻咽喉头颈外科医师面临的难题。多年来,人们在大量的动物实验和临床研究的基础上,应用自体、同种异体以及人工替代材料修复缺损,取得了一定的疗效。然而移植组织的来源限制,供区的再缺损,异体移植引发的排斥反应以及材料与机体难以很好融合等问题始终存在。组织工程技术的日益发展和成熟,为解决这上述难题带来了希望。种子细胞、生物支架材料以及细胞生长调节因子是组织工程技术的基本要素,由于自体或异体软骨细胞作为软骨缺损修复的种子细胞,存在数量上的局限性以及传代培养易于老化等问题,使得获取数量丰富、生长分化能力较强的新的种子细胞成为组织工程学领域的关键课题。存在于骨髓基质中的间充质干细胞(bone marrow
龙娟[10]2008年在《人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达》文中指出胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素,它作为人体内功能性多肽,是迄今能诱导胰岛素分泌的最强物质,可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌,提高受体对胰岛素的敏感性,消除胰岛素抵抗引发的各种并发症,其最显着的功能是促进胰岛β-细胞功能再生,防止胰岛凋亡,明显改善糖尿病人的血糖水平。如前所述,GLP-1能通过刺激胰岛β细胞的增殖和新生,使β细胞数量增加,对Ⅱ型糖尿病的治疗具有重要的意义。但GLP-1在体内被二肽基肽酶(dipeptidy1 proteaseⅣ,DPP-Ⅳ)水解后,形成无活性的GLP-1(9-36)NH_2,成为胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1receptor,GLP-1R)的体内天然拮抗剂,因此它在体内的半衰期不足5分钟。其短的体内半衰期决定了只有频繁、反复地给药才能取得令人满意的疗效,这一点极大地限制了GLP-1的临床应用。而且化学合成hGLP-1不仅成本高,而且合成产率低,不利于产业化规模生产。为此,本论文构建了人胰高血糖素样肽hGLP-1的突变体基因~2Gly-hGLP-1,并使之与人血清白蛋白HSA进行融合,由于大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统具有明显的缺陷,因此本课题选用比较成熟的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达系统,使~2Gly-hGLP-1-HSA融合基因在毕赤酵母中获得高表达,并对纯化条件进行摸索,同时对纯化后的~2Gly-hGLP-1-HSA融合基因的生物学活性进行了鉴定,为今后长效GLP-1的研究与产业化发展奠定基础。本研究通过人工合成和PCR相结合的方法获得人胰高血糖素样肽-1突变体基因片段~2Gly-hGLP-1,同时获得了~2Gly-hGLP-1和白蛋白的融合基因~2Gly-hGLP-1-HSA(~2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽(GGGGG)接头作为连接肽),构建了能在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的重组表达载体(pPIC9/~2Gly-hGLP-1-HSA),通过电击转化到巴斯德毕赤酵母(GS115)中并进行诱导表达,筛选得到的高表达菌株经5L发酵罐发酵培养,分离纯化后,目的蛋白纯度可达到95%以上,浓度为为1.24g/L。通过动物实验证实了在毕赤酵母中分泌表达的重组蛋白~2Gly-hGLP-1-HSA具有控制血糖的生物活性。现将主要研究结果总结如下:1.通过人工和PCR相结合的方法得到了~2Gly-hGLP-1基因,确定了所用的PCR条件为:94℃变性5min,65℃退火5min,72℃延伸10mm,2个循环。一步PCR得到目的基因为90bp。2.通过已经得到的~2Gly-hGLP-1基因和白蛋白基因进行融合,确定了PCR条件为:94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,共进行30个循环,最后72℃延伸10min,获得的融合基因长度为1884bp。3.得到的~2Gly-hGLP-1-HSA基因经过EcoRI+XhoI双酶切,连接到pPIC9载体后在大肠杆菌DH5α进行克隆,并且菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。4.制备了巴斯德毕赤酵母(GS115)感受态细胞,重组表达载体(pPIC9/~2Gly-hGLP-1-HSA)通过电击转化到感受态细胞中,电转化参数为电压2.0KV,电击时间4.5ms,通过MD平板筛选得到工程菌株。5.确定了工程菌诱导的起始时间和收获时间:工程菌株接种于BMGY培养基中,当菌液OD_(600)=1左右时,添加0.5%的无水甲醇进行诱导,每12h补加0.5%甲醇,经过10%SDS-PAGE电泳检测,结果表明有目的蛋白条带(~2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白为69.5kD),并且在摇瓶条件下,随着诱导时间延长,目的蛋白表达量有累积趋势,并且在诱导84小时内,没有出现目的蛋白降解的情况。6.在5L发酵罐进行了多批次的发酵培养实验,基本摸清了各项控制参数,获得了稳定高效的表达,5升发酵罐上的表达量超过了100mg/L。7.初步确定了~2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的纯化工艺:发酵产物离心取上清,依次通过阳离子交换柱SP Sepharose F.F,疏水层析Phenyl Sepharose HP,阴离子交换柱Source 30 Q和分子筛Superdex 75纯化,取各步洗脱液做10%SDS-PAGE电泳分析。结果表明经纯化后样品中的杂蛋白明显减少,目的蛋白纯度可达到95%以上,并用Lowry法测定纯化后~2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的浓度为1.24g/L。8.对昆明小鼠的糖耐量实验表明,皮下注射3.5mg/Kg纯化后的融合蛋白~2Gly-hGLP-1-HSA后20min即可显着地抑制血糖升高的趋势(P＜0.05),整个过程中血糖的升高程度明显比对照组(皮下注射等体积的生理盐水)缓利,说明~2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白具有降血糖活性。
参考文献：
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[2]. 猪HOXA10基因的表达调控研究及激素诱导型启动子转基因小鼠与猪的制备与鉴定[D]. 吴迪. 华中农业大学. 2012
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[4]. 《第叁军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第叁军医大学学报. 2002
[5]. 兔生长激素的表达、纯化和鉴定[D]. 李宏昊. 天津大学. 2008
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[7]. 新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究[D]. 王崧. 第叁军医大学. 2013
[8]. 转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学. 2010
[9]. 人生长分化因子-5基因转染骨髓间充质干细胞及用于软骨缺损修复的初步研究[D]. 任晓勇. 第四军医大学. 2005
[10]. 人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达[D]. 龙娟. 西南大学. 2008
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