程道军[1]2003年在《家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析》文中研究说明表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)是生物基因组中最有价值的基因结构信息。构建生物特定组织、器官或细胞的cDNA文库并进行大规模EST测序分析，能直接获得大量的功能基因结构及表达特征，并以此来构建各种组织器官的基因表达谱。 家蚕是一种重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式生物。本研究选取了家蚕丝腺、生殖腺、中肠、脂肪体、血液、卵(胚胎期)、卵巢培养细胞等12种不同发育阶段的重要组织器官，分别构建其cDNA文库，再对每个文库进行大规模EST测序分析，以期发现与家蚕性别调控、变态发生、胚胎发育、能量代谢和物质代谢等密切相关的功能基因。家蚕脂肪体担负着体内物质贮存、能量供给和中间代谢等重要生理功能，是典型的变态模式组织。因此，本文主要通过对脂肪体EST数据的分析，研究家蚕变态过程中脂肪体的基因表达情况，获得参与家蚕变态的功能基因群，以期从分子水平阐明家蚕变态发生的作用机制。 1、家蚕cDNA文库的构建 提取高质量的12种家蚕组织器官的总RNA和mRNA，合成带有EcoRⅠ和XhoⅠ粘性突出末端的双链cDNA片段；电泳回收≥500bp的cDNA片段，定向克隆入pBluescript ⅡSK(+)质粒载体。将重组质粒转入受体菌HB101中，得到实验所需的cDNA文库。文库重组率平均为93％，原始库容平均为1.23×10~5克隆／ml，外源插入cDNA片段的大小平均在400-1500bp之间，表明文库质量较高。 2、家蚕大规模EST测序 对家蚕12个组织的cDNA文库进行大规模EST测序。通过去除载体序列、重复序列以及细菌DNA序列等处理，共获得81625条有效的EST序列，序列长度集中在250～550bp之间。 对EST序列进行聚类分析和拼接，共获得24678个UniGene(非重复序列)，其中包括11627个contig(重迭序列)，13051条singletons(独立EST)。contig序列大小集中在200～1200bp之间，由此推测，家蚕中决定蛋白质编码的mRNA长度大部分为1200bp以下。 家蚕EST序列同源性分析的参数标准为：blastx为E≤E-15，Alignment≥30％；blastn为E≤E-10，Alignment≥25％。同源性分析共检索到有7944个UniGene同已知基因数据同源，其中(1)同源且有功能注释的功能已知基因有3899个UniGene、共计32605条EST；(2)有同源但无功能注释的已知序列有4045个UniGene、共计16087个EST；（3）新的序列有16734个UniGene、共计32933个 EST。 家蚕功能已知基因EST数据除了部分与GeneBank中家蚕基因数据同源外，还与果蝇、烟草天蛾、人、小鼠、按故等26个物种的登录基因同源；同时发现了许多参与家蚕性别决定和生长发育调控的重要功能基因，以及与细胞分化、信号传导、组织发生等密切相关的功能基因信息．3、家蚕脂肪体基因表达谱分析3．l脂肪体基因表达概况 家蚕脂肪体cDNA文库测得19030条EST序列，聚类分析获得6337个UniGene，其中包括4262个。。ntig、2075个独立EST．同源性分析发现：（1）功能已知的UniGene有1226个，包括1196个。。ntig、30条勾nde加＊s，共计9264条田T，这些UniGe11e共注释为5肥个基因。（二）已知序列的UniGene有1341个，包括1030个。。ntig、309条singletons，共计2871条EST．m、新的UniGene序列有3770个，共计6895条EST。 502个注释基因中，高丰度基因有117个，包括8179条EST序列：中丰度基因有234个，共包括933条EST序列；低丰度基因有151个。 脂肪体所有己知基因在分子细胞生物学水平上大致可分为细胞骨架蛋白、胞外基质、激素与激素调节、信号转导与细胞调节、膜相关蛋白、转录翻译调节、能量代谢、物质代谢等八类基因。3．2脂肪体己知基因的表达差异 分析表明，幼虫期脂肪体表达较多的是与物质代谢、转录翻译调节、信号转导调节、能量代谢相关的基因；蛹期则是与物质代谢、细胞骨架蛋白、转录翻译调节、膜相关蛋白等相关的基因表达较多。 幼虫期和蛹期脂肪体的基因表达表现出发育阶段上的差异。八类基因中，细胞骨架、胞外基质、信号转导与细胞调节因子、转录翻译调节、能量代谢和物质代谢等六类基因在不同发育时期的表达存在显着差异，差异可信性大于0．999，激素与激素调节以及膜相关蛋白质的表达差异可信性低于0．5。脂肪体已知基因的EST数据分析显示，胞外基质、信号转导与细胞调节、转录翻译调节、能量代谢和物质代谢相关基因在幼虫期表达量较高；而细胞骨架蛋白相关基因在幼虫期表达较低，蛹期较高。幼虫期和蛹期参与激素与激素调节、膜相关蛋白形成的相关基因表达水平相当，差异较小。 幼虫期脂肪体八类已知基因在雌雄个体之间的表达差异不显着，表达水平相当。3．3脂肪体发育特异性EST数据的的生物信息学分析 V 对脂肪体高表达或特异表达可能与家蚕变态相关的EST数据进行了生物信息学分析，包括幼虫期的贮存蛋白（SPI、SPZ、Arylpborin）、30KD protein、collag。n alpbal、yellow－f；蛹期的bllin－binding p。teiu、hemOli。、bombyxin、Innexin、y。flow－Q等
沈以红, 程道军, 查幸福, 夏庆友, 向仲怀[2]2004年在《家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究 Ⅰ.家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析》文中研究指明以大规模EST测序为基础 ,用生物信息学方法分析了家蚕 5龄 3d脂肪体组织基因表达的特征 ,共获取脂肪体组织EST 12 72 1个。经Phrap程序拼接得到 2 316个非冗余序列 ,其中包括 82 4个contigs,14 92个singletons。在鉴定出的已知基因中 ,基因表达频率有明显差异 :物质代谢相关基因表达量最高 ,占总量的 5 8 2 % ;其次为转录翻译调节相关基因和酶类基因 ,分别占 15 5 %和 14 5 %。在高量表达基因中 ,有贮藏蛋白、蛋白酶抑制剂、类IDGF蛋白、抗菌蛋白、谷胱甘肽 S转移酶等。结果表明 ,脂肪体组织基因表达的种类很多 ,特征明显 ,与脂肪体在蚕体内的贮藏功能、蛋白质合成功能、代谢调节功能以及变态发育有密切关系。
参考文献：
[1]. 家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析[D]. 程道军. 西南农业大学. 2003
[2]. 家蚕脂肪体组织基因表达谱的研究 Ⅰ.家蚕5龄中期幼虫脂肪体组织基因表达分析[J]. 沈以红, 程道军, 查幸福, 夏庆友, 向仲怀. 蚕业科学. 2004
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