朱雅妮[1]2004年在《谷氨酸转运蛋白的结构与功能的研究》文中进行了进一步梳理兴奋性氨基酸转运蛋白 EAAC1 是一种受 Na+-,K+-浓度梯度驱动的产电型转运蛋白。另外,在 Na+和谷氨酸存在的情况下,这一转运蛋白能够介导谷氨酸非偶联的离子流动。蛋白 N-端的前两个跨膜区对于形成离子通道模式非常重要,它们与胞外区的交界处均为带正电的精氨酸残基,R39 和 R61,这两个位点在同一家族中的所有成员中都是保守的。另一个保守的酪氨酸残基,Y98,也可能对于 Cl-流的形成非常重要。将精氨酸和酪氨酸残基突变为丙氨酸后,我们通过测量谷氨酸的重摄取和谷氨酸诱导的电流来研究突变对转运蛋白功能的影响。突变体 R39A 对于转运和通道模式几乎毫无影响。但是另一个精氨酸突变体,R61A,却能够在减弱转运活性的同时刺激通道的形成。并且使得谷氨酸重摄取和谷氨酸依赖电流的表观 Km值减小。谷氨酸对电流的激活似乎伴随着一个电压依赖的过程,而在 R61A 突变体中,电荷移动的表观效价减小了。突变体 Y98A 导致转运功能的减弱以及谷氨酸表观 Km值减小,在通道模式中,强烈减小了对于 NO3和 Cl-的选择性。
鲁斐然[2]2011年在《大肠杆菌膜蛋白UraA和AdiC的结构和转运机制》文中进行了进一步梳理协同运输转运蛋白利用离子浓度梯度提供的势能将底物转运到细胞内部。它们在细胞的一侧结合底物，经过构象变化将底物转运进入细胞。协同运输转运蛋白包括同向转运蛋白和反向转运蛋白。大肠杆菌的UraA蛋白是质子和尿嘧啶的同向转运蛋白，AdiC蛋白是精氨酸和胍基丁胺的反向转运蛋白。UraA蛋白属于NAT/NCS2家族，负责同向转运质子和尿嘧啶进入大肠杆菌。人的维生素C转运蛋白SVCT1和SVCT2，以及哺乳动物的尿嘧啶转运蛋白SNBT1也属于这一家族。为了进一步了解UraA和NAT/NCS2家族的工作机制，我们对UraA的叁维晶体结构进行了解析。我们得到的分辨率为2.8的UraA结构一共有14次穿膜区域。与其他已知结构的转运蛋白比对和对Dali数据库检索结果显示，Ura的叁维结构是一种全新的折迭方式。UraA结构呈现底物尿嘧啶结合的向内开口的构象。UraA结构中的TM3和TM10的穿膜区域上有一段反向平行的β-折迭片结构，这段结构对于底物尿嘧啶的结合和转运有着重要的作用。这也是在转运蛋白中首次报道了β-折迭的存在。接下来，我们对UraA进行了一系列的生化实验研究，验证了转运过程中的重要氨基酸的作用。此外，通过分析分子内部的相互作用，我们将UraA的分为核心结构域和门控结构域，在转运的过程中核心结构域主要负责结合底物，而门控结构域负责整个蛋白构象的变化。这些结构和生化的实验使我们对UraA转运机制的了解有了很大的提高，为整个NAT/NCS2家族的结构以及转运机制的阐明奠定了基础。本文中另外一个反向转运蛋白AdiC属于APC超家族，负责将大肠杆菌胞外的精氨酸运输进入胞内，同时将胍基丁胺运至胞外。AdiC是毒性菌株大肠杆菌的抗酸系统的重要组成成员。我们解析了3.6的AdiC的向外开口构象的无底物结合的叁维晶体结构，属于LeuT折迭方式。接下来，我们对AdiC蛋白进行了生化研究，从而找到了底物转运过程中起重要作用的氨基酸。经过同组其他成员的努力，我们又解析了N22A突变体AdiC结构，这个结构为精氨酸结合的闭合中间态的构象。综合这两个构象的结构和一系列生化试验，我们确定了AdiC底物精氨酸的结合位点，以及两种底物的转运途径，为整个转运循环通路提供了重要的结构和生化基础。
刘辉[3]2007年在《鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的作用及其机制研究》文中研究表明鱼藤酮(rotenone)是由醉鱼科植物毛鱼藤(derris)的胶状液汁提取的化学物质,自20世纪40年代以来一直被视为安全有效的杀虫剂而广泛应用于农业除害。但是近年来发现,这个既往被认为对人畜毒性低的农药,对机体的神经系统功能可产生一定影响,特别是它对中枢神经的毒性作用以及可能与帕金森病(Parkinson disease,PD)存在着的潜在联系更是人们关注的焦点。帕金森病的主要病理学特征是黑质致密部多巴胺神经元的丢失以及Lewy小体(Lewy body)的形成。给予鱼藤酮后大鼠能产生这些病理变化,并出现类帕金森病的症状,很好地模拟了人类PD的特征改变。但迄今为止,鱼藤酮与PD发病的相关作用机制仍不十分清楚。因此,从分子水平上揭示鱼藤酮所致PD发生的机制与病理变化的关系对PD的防治具有十分重要的意义。兴奋毒性作用与PD等神经退变性疾病的关系已成为近年研究的热点之一。目前公认,谷氨酸(glutamate, Glu)引起的兴奋毒性是中枢神经系统出血、创伤和神经退行性疾病等神经元死亡的重要机制。大量的研究证据也表明,多种原因所致的过度释放的谷氨酸,可通过其相关受体介导的兴奋性神经毒作用,导致黑质纹状体DA能神经元变性或坏死。分布于星形胶质细胞的高亲和力谷氨酸转运体对谷氨酸的再摄取,是谷氨酸递质灭活的主要途径。再摄取功能障碍无疑能加重谷氨酸及其受体介导的兴奋性神经毒作用,导致神经退行性病变的发生与发展。由此推测,鱼藤酮对黑质纹状体多巴胺神经元选择性毒性作用,可能与其破坏星形胶质细胞的谷氨酸转运系统功能有某种关系。为此,本实验围绕谷氨酸代谢相关酶类及其转运体进行了深入研究,以寻找鱼藤酮多巴胺能神经元选择性毒性作用机制,藉以为PD等神经退变性疾病的防治研究提供新的思路。方法:1:鱼藤酮大鼠PD损伤模型:建立SD大鼠皮下注射鱼藤酮与Alzet微泵恒流给药两种模型,染毒时间为28 d。利用光镜和免疫组织化学方法观察大鼠纹状体病理损伤、神经元变性改变以及星形胶质细胞增生反应;HPLC与同位素标记法检测纹状体胞外谷氨酸浓度和突触体谷氨酸转运能力;RT-PCR、Western Blot及生化分析测定GLAST,GLT-1,GS基因表达和蛋白活性。2:离体星形胶质细胞鱼藤酮染毒模型:观察鱼藤酮对星形胶质细胞的毒性作用;RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学检测GLAST, GLT-1, GS基因和蛋白表达;GLT-1特异性抑制剂DHK,GLAST非特异性抑制剂PDC和GS特异性抑制剂MSO对鱼藤酮染毒星形胶质细胞Glu转运的干预作用;钙离子成像分析系统监测星形胶质细胞[Ca2+]i动态变化;并探讨CaMKⅡ在鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍中的作用。结果:一、鱼藤酮染毒动物模型1.大鼠自主活动减少,出现类帕金森病症候群特征;微泵给药高剂量组症状较皮下注射大鼠出现更早且更为严重,部分动物陆续出现典型的阵挛性惊厥,前肢、头面肌阵挛发作,全身肌紧张等现象。2.大鼠纹状体组织形态学发生改变:神经元层次减少,细胞间隙增宽,神经纤维排列紊乱,结构疏松,部分神经细胞丧失典型的多角形状而变为圆形。3.大鼠纹状体组织出现FJB染色阳性神经元,说明鱼藤酮染毒诱导中脑神经元变性损伤。4.大鼠纹状体GFAP阳性细胞数量明显增多,染色加深,胞体增大增粗,GFAP蛋白表达与对照组比较显着增强(P<0.01),提示鱼藤酮诱导星形胶质细胞增生化反应。5.大鼠纹状体细胞外液Glu浓度升高,鱼藤酮浓度为1.2mg/kg时,Glu浓度与对照组比较有显着差异(P <0.05)。6.大鼠纹状体突触体Glu摄取功能降低,鱼藤酮浓度为2.0mg/kg和4.0mg/kg时,摄取能力与对照组比较非常显着地降低(P <0.01)。7.大鼠纹状体GLAST基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而降低,0.6mg/kg和1.2mg/kg鱼藤酮染毒组与对照组比较差异显着(P <0.05)和非常显着(P <0.01)。8.大鼠纹状体GLT-1基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加,1.2mg/kg鱼藤酮染毒组与对照组比较具有非常显着的统计学意义(P <0.01)。9.大鼠纹状体GS基因表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加, 0.6mg/kg和1.2mg/kg鱼藤酮染毒组GS活性与对照组比较非常显着的升高(P <0.01)。二、鱼藤酮染毒星形胶质细胞模型1.细胞形态学发生明显改变,细胞间距增大,数目减少,部分细胞圆缩肿胀,甚至脱壁呈悬浮状态生长。2.细胞活性显着降低,LDH释放量增加。但与PC12细胞比较,星形胶质细胞对同等剂量的鱼藤酮染毒具有更强的耐受能力。3.染毒细胞增殖受到明显抑制,细胞缝隙连接蛋白CX43表达降低,以此结构为基础的细胞缝隙连接受到影响。4.鱼藤酮显着降低体外培养的星形胶质细胞Glu摄取功能,导致胞外Glu浓度明显升高。5.星形胶质细胞Na+/K+_ATP酶活性随着鱼藤酮浓度的增加而降低,具有剂量依赖趋势。6.染毒星形胶质细胞GLAST深染细胞数量减少,基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而明显降低(P<0.01);GLT-1深染的细胞数量明显增加,基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而显着增强(P <0.01)。7.染毒星形胶质细胞GS基因表达随着鱼藤酮浓度的增加而增强,GS活性升高,与对照组比较具有非常显着的统计学意义(P <0.01)。8.与单纯鱼藤酮中毒比较,PDC显着抑制星形胶质细胞Glu摄取功能,而DHK抑制作用并不明显,提示GLAST可能在鱼藤酮所致星形胶质细胞Glu转运功能障碍中占主要地位。9.与单纯鱼藤酮中毒比较,MSO显着抑制星形胶质细胞Glu摄取功能,说明GS参与了鱼藤酮所致星形胶质细胞Glu转运功能障碍。10.鱼藤酮可明显促进星形胶质细胞钙离子浓度的升高。且随着鱼藤酮浓度的增加,胞内钙离子浓度增高的趋势更为明显。钙离子浓度出现增高所需的时间也随着鱼藤酮浓度的增加而缩短。细胞外液钙离子内流与胞内钙库释放均参与了细胞内钙离子浓度的增加。11.鱼藤酮中毒引起星形胶质细胞磷酸化CaMKⅡ蛋白表达增强,从而导致胞内Ca2+依赖的CaMKⅡ活性明显降低。12.使用KN-62保护CaMKⅡ活性后,星形胶质细胞谷氨酸转摄取功能较单纯鱼藤酮组明显增强(P <0.05),说明CaMKⅡ参与谷氨酸摄取过程并具有促进作用。结论:1、成功建立了鱼藤酮背部皮下注射和微泵恒流给药两种动物模型。研究发现,鱼藤酮对大鼠纹状体组织具有毒性作用,可使神经元发生形态学改变并发生变性损伤,星形胶质细胞出现增生化反应,后者可能参与了鱼藤酮的神经毒性作用。2、鱼藤酮显着降低纹状体突触体Glu摄取功能,造成组织间隙Glu浓度明显升高,这可能是鱼藤酮致多巴胺神经元损伤的重要原因之一。3、鱼藤酮对体外培养的星形胶质细胞具有明显的毒性作用。主要表现为细胞形态发生明显改变,活力降低,胞膜受损,引起细胞活力改变的最小暴露剂量高于引起细胞形态改变的最低剂量,说明体外培养细胞对毒物敏感程度较高,细胞容易脱壁,虽然细胞形态有明显改变,但细胞仍具活力;与神经元PC12细胞比较,星形胶质细胞对同剂量鱼藤酮染毒的耐受能力更强;此外,染毒细胞增殖分化受到抑制,以CX43为结构基础的细胞缝隙连接受到明显破坏。4、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLAST基因表达下调,蛋白活性显着降低,可能是引起鱼藤酮所致Glu摄取功能下降的主要原因之一。5、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLT-1基因表达增强,蛋白活性显着升高。两种转运体在中毒后出现不同的反应,提示它们的功能活性在胞内可能受不同机制调控,GLT-1表达上调可能是机体对Glu浓度升高作出的代偿性保护反应。6、鱼藤酮染毒细胞和组织Na+/K+_ATP酶活性随着鱼藤酮浓度的增加而降低。Na+/K+_ATP酶活性的降低一方面使依赖于ATP的GLAST和GLT-1转运功能障碍,影响谷氨酸摄取和转运,造成中枢神经元的兴奋性损伤;另一方面可导致离子交换功能障碍,引发细胞内Ca2+超载。7、鱼藤酮染毒细胞和组织GS基因和活性表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加。此变化有助于加快突触间隙Glu合成为谷氨酰胺(Gln),可能是星形胶质细胞为保护神经元作出的反应。8、在GLT-1特异性抑制剂DHK干预处理组,星形胶质细胞Glu转运能力略有下降,但与单纯鱼藤酮中毒组比较无统计学意义。提示GLT-1于此浓度鱼藤酮染毒条件下,在星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低过程中,并非占据主导地位。9. GLAST非特异性抑制剂PDC干预处理后,星形胶质细胞Glu转运能力下降,与单纯鱼藤酮中毒组比较有显着的统计学意义。提示与GLT-1相比,GLAST的下调是星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低的主要因素。10.采用谷氨酰胺合成酶特异性抑制剂MSO干预处理后,染毒星形胶质细胞Glu转运能力下降,与单纯鱼藤酮中毒组比较有显着的统计学意义。提示GS亦参与了鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍。11、鱼藤酮诱导星形胶质细胞[Ca2+]i增加,且随着鱼藤酮浓度的增高,[Ca2+]i增高的趋势更为明显;在无钙缓冲液环境下,可见曲线平缓,峰值下降,峰值时荧光强度增加值?F显着降低;细胞内钙库释放抑制剂TMB-8显着抑制鱼藤酮引起的[Ca2+]i升高,但与无钙环境比较,其抑制作用的发生时间稍迟。上述结果提示细胞外钙的内流与细胞内钙的释放均参与了峰值的形成。细胞分别用尼莫地平与MK-801预处理后,[Ca2+]i上升变的缓和,?F显着降低。但无论是峰值还是观察结束时的钙水平,MK-801预处理组都未达到尼莫地平预处理组的抑制水平,表明鱼藤酮引起的细胞外钙的内流主要是通过电压门控钙通道进行的。12、鱼藤酮诱导的胞内钙超载,使CaMKⅡThr286发生自身磷酸化,从Ca2+依赖形式转变为非Ca2+依赖而活化,活性持续存在,而Ca2+依赖活性显着下降。KN-62能抑制Glu介导的CaMKⅡ自身磷酸化,从而保护Ca2+依赖活性。将星形胶质细胞用KN-62预处理后,发现鱼藤酮中毒后星形胶质细胞谷氨酸摄取功能较单纯中毒组有显着提高,提示CaMKⅡ可能参与了谷氨酸转运体摄取功能的调节。综上所述,鱼藤酮通过影响星形胶质细胞GluTs的表达及GS活性,增加脑内Glu释放,可能是其发挥神经毒性的重要机制之一。其结果提示:探索在线粒体抑制类农药中毒条件下,如何保护受损的星形胶质细胞(如加入外源性神经保护因子、BDNF等),进而持续提高GluTs及GS的表达和功能活性,对于保护中枢神经元可能具有重要意义。
谷玮玮[4]2018年在《舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CAI区GLT-1结合特性、谷氨酸摄取及谷氨酸浓度的影响》文中认为谷氨酸(Glu)是中枢神经系统中最广泛的神经递质,广泛参与中枢神经系统生理功能的调节。谷氨酸能神经元受到刺激去极化后将谷氨酸释放到突触间隙中,其浓度由几微摩尔瞬时升高至几毫摩尔,激活谷氨酸受体,从而发挥生理功能。在某些病理条件下,突触间隙内谷氨酸浓度异常升高,过度激活突触后膜的离子型和代谢型谷氨酸受体,引起大量Ca~(2+)及Na~+离子内流,触发并激活细胞内的信号级联反应,启动一系列病理反应过程,神经元膜结构破坏,细胞内成分的释放,局部炎性反应性水肿甚至坏死或者凋亡,引起谷氨酸的兴奋性毒性作用。由于突触间隙内没有分解谷氨酸的代谢酶,突触间隙内的谷氨酸由谷氨酸转运体从突触间隙中清除。在所有类型的谷氨酸转运蛋白中,胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate transporter,GLT-1)清除皮质和海马中释放的大部分谷氨酸。在海马中表达的大约80%的谷氨酸转运蛋白是GLT-1。鉴于谷氨酸的兴奋性毒性作用在脑细胞缺血缺氧性损害中的重要作用,提高谷氨酸转运体清除谷氨酸的能力,即增加GLT-1的表达及功能可作为治疗脑缺血性疾病的靶点。研究发现,用β-内酰胺类抗生素,如头孢曲松钠可上调GLT-1的表达和摄取活性。我室以往研究也表明,头孢曲松钠可通过上调GLT-1的表达发挥抗全脑缺血的神经保护作用。这些研究虽然证实了头孢曲松钠的神经保护作用,但是其作为一线强效抗生素,长期大量使用会导致诸如菌群失调、细菌耐药等许多副作用,这些副作用严重限制其作为抗脑缺血性损伤药物的应用。舒巴坦(sulbactam)属于非典型β-内酰胺类抗生素,与头孢曲松钠结构相似,具有β-内酰胺环,但抗菌作用非常弱,临床上一般将其作为β-内酰胺类抗生素的增效剂,与其它β-内酰胺类抗生素合用以增强抗菌效果。鉴于舒巴坦与头孢曲松钠结构的相似性,舒巴坦有可能通过上调GLT-1的表达和功能而发挥与头孢曲松钠类似的神经保护作用;同时,考虑到舒巴坦几乎无抗菌作用,不会产生菌群失调等副作用,我室针对舒巴坦的抗脑缺血作用展开了一系列的研究,证实舒巴坦也可通过上调GLT-1的表达发挥抗缺血性脑损伤作用。但是,在这一过程中,舒巴坦对于GLT-1的功能,包括其与谷氨酸的结合特性和对谷氨酸的摄取能力是否发生变化?这些变化对脑缺血时脑细胞外液谷氨酸浓度是否产生影响等,尚未阐明。因此,本研究采用全脑缺血再灌注模型大鼠,应用放射性配基结合方法(L-~3H-glutamate标记法),观察舒巴坦对全脑缺血大鼠海马GLT-1结合特性及其对谷氨酸摄取的影响。在此基础上,应用微透析及高效液相联合质谱法,观察GLT-1的上述变化对脑组织细胞外液谷氨酸浓度的影响,为阐明GLT-1在舒巴坦发挥抗缺血性脑损伤作用提供进一步的实验依据,同时也为临床上脑缺血性疾病的防治研究提供新的线索和思路。第一部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1结合特性的影响目的:观察舒巴坦在抗全脑缺血过程中,对GLT-1的结合特性,包括最大结合量和亲和力的影响,探讨舒巴坦对GLT-1功能的影响。方法:应用神经病理学评价方法,在确定舒巴坦发挥抗全脑缺血、发挥神经保护作用的基础上,应用~3H标记的谷氨酸(L-~3H-glutamate)进行放射性配基结合实验,观察确定这一过程中GLT-1的结合特性的变化。将Wistar大鼠随机分为以下7组,每组11只。6只用于GLT-1结合特性的测定,5只用于神经病理学评价。1.Sham对照组:给大鼠侧脑室注射舒巴坦的溶剂生理盐水(normal saline,NS)10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血的sham手术。2.全脑缺血组(Brain ischemia):给大鼠侧脑室注射舒巴坦的溶剂NS 10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血处理(8 min,以下同),之后恢复脑血液再灌流。3.舒巴坦对照组(Sulbactam control):给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液10μl(180 nmol,以下同),连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血的sham手术。根据我室崔鑫等的研究,选择舒巴坦侧脑室注射的有效剂量180 nmol。4.舒巴坦预防组(Sulbactam prevention):给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液10μl,连续注射5 d,于末次注射后24 h行全脑缺血处理,之后恢复脑血液再灌流。5.舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组(Sulbactam prevention+AS-ODNs):在舒巴坦预防组的基础上,于第一次注射舒巴坦后36 h、72 h以及全脑缺血处理前12 h右侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs双蒸水溶液10μl(18 nmol);其它同全脑缺血组。同时设R-ODNs对照组(Sulbactam prevention+R-ODNs),以R-ODNs(18 nmol)代替AS-ODNs,其它同舒巴坦预防组+GLT-1 AS-ODNs组。6.GLT-1 AS-ODNs对照组(AS-ODNs control):在sham组基础上,于第一次注射舒巴坦的溶剂后36 h、72 h以及全脑缺血sham手术前12 h右侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs溶液10μl(18 nmol),其它同sham组。各组大鼠于规定时间点,即:全脑缺血后即刻、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d取材用于GLT-1结合特性的测定,7 d取材用于脑组织病理学评价。采用放射性配基结合法测定GLT-1的结合特性,包括最大结合量(Bmax值)和亲和力(Kd值)。Bmax值越大,GLT-1的数量越多;Kd值越小,GLT-1的亲和力越高。结果:1.Bmax值的变化与sham组相比,舒巴坦对照组中各时间点Bmax值明显升高(P<0.05),而在GLT-1 AS-ODNs对照组中则明显降低(P<0.05)。全脑缺血组大鼠在8 min缺血打击后,与缺血后即刻时间点相比较,Bmax值呈现下降趋势,48 h-72 h下降加剧,在本实验检测时间段内于3 d(72 h)时降至最低(P<0.05 vs 0 h、6 h);与sham组相比较,各个时间点的Bmax值均明显降低(P<0.05)。舒巴坦预防组中,与缺血后即刻时间点相比较,随着缺血后时间延长,缺血后6 h、12 h、24 h Bmax值逐渐降低(P<0.05,vs 0 h),其后Bmax值逐步回升,72 h时间点Bmax值与24 h时间点相比明显上升(P<0.05);与全脑缺血组相比,舒巴坦预防组各时间点Bmax值均明显增加(P<0.05)。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组中,与缺血后即刻时间点相比较,随着缺血后时间的延长,各时间点Bmax值逐渐降低(P<0.05,vs 0 h);与舒巴坦预防组相比,各时间点Bmax值均明显下降(P<0.05),表明舒巴坦通过上调GLT-1并增加Bmax的作用被GLT-1 AS-ODNs抑制,而舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs组Bmax值的变化与舒巴坦预防组相比较无显着性变化(P>0.05)。2.Kd值的变化与sham组相比,舒巴坦对照组和GLT-1 AS-ODNs对照组各个时间点的Kd值均无显着性变化(P>0.05)。全脑缺血组中,与缺血后即刻时间点相比,各个时间点Kd值呈现明显上升的趋势,于24 h-48 h升高最明显;与sham组相比,各个时间点的Kd值均明显升高(P<0.05)。舒巴坦预防组中,与缺血后即刻时间点相比,各时间点Kd值变化趋势与全脑缺血组一致;与全脑缺血组相比,各时间点的Kd值均显着降低(P<0.05)。在舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组中,与缺血后即刻时间点相比,各时间点Kd值无明显变化;与舒巴坦预防组相比,各时间点Kd值均明显升高(P<0.05)。而舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs组与舒巴坦预防组Kd值无差异。3.神经病理学评价结果Sham组大鼠海马CA1区锥体细胞形态完整,无细胞缺失,并且排列整齐,层次分明。胞核大而圆,位于细胞中央,核仁清晰,尼氏体丰富。舒巴坦对照组大鼠海马CA1区锥体细胞组织形态与sham组基本一致。在全脑缺血组中,海马CA1区锥体细胞稀疏无层次感,排列紊乱,可见大量细胞碎片,并且出现了明显的神经元缺失,组织学分级显着升高(P<0.05),神经元密度显着下降(P<0.05)。舒巴坦预防组海马CA1区锥体细胞损伤不明显,其组织细胞形态与全脑缺血组相比明显好转,更接近sham组。与全脑缺血组相比,组织学分级明显降低(P<0.05),神经元密度显着升高(P<0.05),表明舒巴坦具有抗全脑缺血引起的迟发性神经元死亡的作用。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组海马CA1区组织细胞细胞形态与全脑缺血组类似,也出现了细胞肿胀,崩解,碎片化及核固缩。与舒巴坦预防组相比,其组织学分级显着升高(P<0.05),神经元密度明显下降(P<0.05),表明GLT-1 AS-ODNs抑制了GLT-1表达从而减弱了舒巴坦对海马CA1区锥体神经元的保护作用;GLT-1 AS-ODNs对照组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致,表明侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs不会对海马CA1区神经元产生损伤。舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs对照组与舒巴坦预防组大鼠海马CA1区组织形态基本一致。以上结果显示:侧脑室注射GLT-1 AS-ODNs可以抑制舒巴坦的抗脑缺血损伤的神经保护作用。小结:以上结果表明,舒巴坦可以改善全脑缺血大鼠GLT-1的最大结合容量并增强其与谷氨酸的亲和力。第二部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1摄取谷氨酸的影响目的:采用大鼠全脑缺血再灌注模型,观察舒巴坦对脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1摄取谷氨酸的影响,探讨舒巴坦对GLT-1功能的影响。方法:实验动物及分组同第一部分。各组大鼠于规定时间点,即全脑缺血后即刻、6 h、12 h、1 d、2 d、3d取材,制备细胞悬液,使用~3H标记的谷氨酸(L-~3H-glutamate)测定海马CA1区细胞对谷氨酸的摄取。GLT-1的谷氨酸摄取量等于总摄取量减去非特异性摄取量。用于病理组织学观察的标本于7 d时取材固定。结果:1.摄取率变化与sham组相比,舒巴坦对照组中GLT-1对谷氨酸的摄取明显增加(P<0.05);GLT-1 AS-ODNs对照组中,GLT-1对谷氨酸摄取有一定程度减少(P<0.05),说明GLT-1 AS-ODNs可通过抑制GLT-1的表达减少GLT-1对谷氨酸的摄取。全脑缺血组谷氨酸的摄取率呈现下降趋势,在本实验中72 h降到最低(P<0.05,vs 0 h)。与sham组相比,随着缺血后时间的延长,摄取率逐渐下降(P<0.05)。舒巴坦预防组中,0 h、6 h、12 h、24 h时间点的摄取率虽无明显变化,但有下降趋势,到48 h-72 h时间点,其谷氨酸摄取率明显升高,到72 h时摄取率已明显高于24 h(P<0.05,vs 24 h);该组与全脑缺血组相比,GLT-1对谷氨酸摄取在各个时间点均明显增加(P<0.05)。舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组GLT-1对谷氨酸的摄取明显降低,并且在48 h-72 h时间段内仍在下降(P<0.05,vs 0 h);与舒巴坦预防组相比,GLT-1对谷氨酸的摄取显着降低(P<0.05)。舒巴坦预防+R-ODNs(18 nmol)组GLT-1对谷氨酸的摄取率的变化趋势与舒巴坦预防组基本一致,各时间点摄取率无明显变化。2.神经病理学评价结果同第一部分结果。3.预防性给予舒巴坦可以有效减轻大鼠海马CA1区锥体神经元的迟发性神经元死亡,并且明显增强大鼠海马CA1区GLT-1对谷氨酸的摄取。而应用GLT-1 AS-ODNs可明显抑制舒巴坦对全脑缺血大鼠神经元的保护作用。小结:这些结果表明舒巴坦可以增加全脑缺血大鼠GLT-1对谷氨酸的摄取。第叁部分舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CA1区谷氨酸浓度的影响目的:应用大鼠全脑缺血模型,观察舒巴坦对海马CA1区脑微透析液中谷氨酸浓度的影响,进一步探讨舒巴坦抗脑缺血性损伤作用的机制。方法:实验动物及分组同第一部分。各组均于全脑缺血前3 h开始脑内微透析,采集微透析样品用于高效液相联合质谱仪进行分析,观察微透析液中谷氨酸浓度的变化;全脑缺血后7 d取材进行脑组织病理学评价。结果:1.氨基酸的分离情况。在本实验条件下,谷氨酸与内标在6 min内均得以分离,其出峰时间分别为:Asp 1.41 min、Glu 1.50 min、Nor 5.25 min,叁种氨基酸峰形良好,无重合、双峰、拖尾等现象(Fig.1)。海马透析液样品中的其他杂峰亦可与待测氨基酸完全分离。2.谷氨酸浓度的变化Sham组脑微透析液中谷氨酸浓度处于较低水平,约2.25±0.361μmol/L,各时间点无明显变化。与sham组相比,舒巴坦对照组脑微透析液中谷氨酸浓度无明显变化。在全脑缺血组中,大鼠海马CA1区谷氨酸浓度出现了明显的升高。在缺血一开始就迅速出现升高,并且迅速升高至基础浓度的7.5倍左右,在恢复血流灌注后,于16 min左右恢复至基础水平。在舒巴坦预防组,给予舒巴坦可明显抑制全脑缺血引起的脑内谷氨酸浓度升高,使其峰值降低到基础浓度的3倍左右,明显低于全脑缺血组(P<0.05)。在舒巴坦预防+GLT-1 AS-ODNs组,谷氨酸浓度在全脑缺血后迅速升高,最高浓度为基础值的5.7倍,明显高于舒巴坦预防组(P<0.05),表明舒巴坦降低缺血时细胞间隙谷氨酸浓度升高的作用可以被GLT-1AS-ODNs明显抑制。而在舒巴坦预防+GLT-1 R-ODNs中却无此变化,说明本实验选择的GLT-1 AS-ODNs可有效的抑制GLT-1的表达及其对谷氨酸的摄取。给sham组动物注射GLT-1 AS-ODNs组,可使其谷氨酸浓度稍有增高,与sham组比较有统计学差异(P<0.05),说明连续3次注射GLT-1AS-ODNs可有效的抑制GLT-1对谷氨酸的摄取。3.神经病理学评价同第一部分结果。小结:以上结果表明,舒巴坦可以降低脑缺血引起的细胞外谷氨酸浓度升高,从而降低其兴奋性神经毒性作用导致的迟发性神经元死亡。结论:1.舒巴坦可以改善全脑缺血大鼠GLT-1的最大结合容量并增强其与谷氨酸的亲和力。2.舒巴坦能够明显增加全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1对谷氨酸的摄取。3.舒巴坦可以降低脑缺血引起的细胞外谷氨酸浓度升高,从而降低其兴奋性神经毒性作用。以上结果表明,舒巴坦可以通过上调GLT-1的功能,降低全脑缺血大鼠海马CA1区谷氨酸浓度,进而发挥抗全脑缺血的神经保护作用。
田光明[5]2014年在《地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶和聚γ-谷氨酸降解酶的研究》文中认为聚Y-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,简称γ-PGA)是一种多功能的生物聚合物,具有可食用、无毒和可生物降解等特性。地衣芽胞杆菌WX-02是重要的聚Y-谷氨酸生产菌株,但菌体胞内谷氨酸合成能力较弱,在聚γ-谷氨酸发酵生产过程中需要添加大量谷氨酸,提高了发酵成本,不利于聚γ-谷氨酸的产业化开发。目前聚γ-谷氨酸代谢中的关键酶在地衣芽胞杆菌WX-02生物合成聚γ-谷氨酸中的作用仍不清楚。本研究通过分析胞内谷氨酸合成和聚γ-谷氨酸合成的代谢途径与关键步骤,并以此为基础,对地衣芽胞杆菌WX-02代谢途径中关键酶的酶学性质、胞内谷氨酸合成和聚γ-谷氨酸降解进行研究,同时利用HPLC、GC-MS和Q-RT-PCR等方法对所构建工程菌株的生理生化变化进行分析。主要结论如下：1.胞内谷氨酸的合成中,有叁种酶参加反应：glnA基因编码的谷氨酰胺合成酶、gltAB基因编码的谷氨酸合成酶和分别由rocG和gudB基因编码的谷氨酸脱氢酶。本研究在Bacillus licheniformis WX-02(简称WX-02)中分别缺失rocG和gltA基因,替换rocG基因启动子,得到相关菌株WX-02△rocG、WX-02△gltA和WX-02P43rocG。经Q-RT-PCR分析发现,WX-02△rocG菌株中未检测到rocG基因转录,WX-02△gltA菌株中未检测到gltA基因转录,WX-02P43rocG菌株rocG基因转录量为WX-02菌株1.54倍。WX-02菌株中,未检测到gudB基因转录,WX-02△rocG中gudB基因转录量为WX-02△gltA菌株的4.72倍。在未添加外源谷氨酸的发酵培养基中,WX-02聚Y-谷氨酸产量为9.82g/L,WX-02△rocG和WX-02P43rocG的聚γ-谷氨酸产量分别为WX-02的54.7%和105%,WX-02△gltA的聚γ-谷氨酸产量与WX-02相比差异不显着。说明在WX-02中,负责胞内谷氨酸合成的酶为谷氨酸脱氢酶(RocG)。2.以WX-02基因组为模板扩增谷氨酸脱氢酶RocG编码基因,克隆至pET-28(+)表达载体后,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得含有重组质粒pET-28b(+)-rocG的重组大肠杆菌菌株,对其进行诱导表达和Ni柱亲和纯化,得到具有均一电泳条带的谷氨酸脱氢酶RocG蛋白。RocG的酶学性质结果表明：该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为8.0,温度低于40℃、pH值6.0-8.5稳定性较好。α-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸的米氏常数Km分别为4.727mmol/L、0.111mmol/L和23.296mmol/L,α-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸的Kcat/Km分别为1.923mmol-1?L?min-1、100.09mmol-1?L?min-1和0.159mmol-1?L?min-1。说明谷氨酸脱氢酶RocG合成谷氨酸催化反应效率比分解谷氨酸高,本研究从体外实验证明了地衣芽胞杆菌WX-02谷氨酸脱氢酶(RocG)主要起生物合成谷氨酸的功能。3.乙醛酸循环可以部分回补TCA循环从而增强胞内谷氨酸合成。aceA基因编码的异柠檬酸裂解酶和aceB基因编码的苹果酸合成酶为乙醛酸循环中关键酶。本研究以WX-02为原始菌株,分别缺失aceA基因和替换aceA基因原有启动子后得到菌株WX-02△aceA和WX-02P43aceA。经Q-RT-PCR检测后发现,WK-02△aceA菌株中未检测到aceA基因转录,WX-02P43aceA菌株中aceA和aceB基因转录量分别提高了3.6和2.8倍。在未添加外源谷氨酸的培养基中,WX-02P43aceA和WX-02△aceA的聚γ-谷氨酸产量为WX-02的115%和66.8%,说明胞内谷氨酸合成需要乙醛酸循环的回补作用,增强乙醛酸循环可以提高聚γ-谷氨酸产量。培养基中分别添加乙醛酸循环抑制剂苹果酸和琥珀酸后,WX-02中aceA基因转录量下降了14%和28%,聚γ-谷氨酸产量分别提升了13.4%和16.5%。分析原因为添加苹果酸和琥珀酸虽然抑制了乙醛酸循环途径,但由于添加物属于TCA循环中间代谢产物,增强了Ⅸ-酮戊二酸向谷氨酸合成的代谢,从而提高了聚γ-谷氨酸合成产量。4.聚γ一谷氨酸降解酶可以降解菌株合成的聚γ-谷氨酸,使其分子量减小。本研究构建了聚Y-谷氨酸降解酶基因pgdS缺失菌株WX-02△pgdS,并以pHY300PLK质粒为基础构建了对照菌株WX-02/pHY菌株和pgdS基因过表达菌株WX-02/pHYpgdS。使用GPC检测WX-02、WX-02/pHY、WK-02△pgdS和WX-02/pKYpgdS生物合成的γ-PGA相对分子量后发现,WX-02△pgdS相对分子量最大,WX-02/pHYpgdS相对分子量最小,WX-02/pHY和WX-02相对分子量一致,说明聚γ-谷氨酸降解酶PgdS可以降低B. licheniformis WX-02生物合成的γ-PGA分子量。在外源添加谷氨酸的培养基中,WX-02和WX-02/pHY聚Y-谷氨酸产量差异不显着,WX-02△pgdS聚γ-谷氨酸产量下降为WX-02的83%,WX-02/pHYpgdS与对照菌株WX-02/pHY相比,聚γ-谷氨酸产量提高54%。经Q-RT-PCR分析,WX-02△pgdS菌株中未检测到pgdS基因转录,谷氨酸转运蛋白基因gltT转录量下降为WX-02的86%,WX-02/pHYpgdS菌株pgdS和gltT基因转录相比WX-02/pHY分别提高了9.86和1.8倍。说明聚γ-谷氨酸降解酶PgdS影响外源谷氨酸向胞内转运,引起聚γ-谷氨酸合成前体物的胞内浓度变化,改变了聚γ-谷氨酸产量。
李敏[6]2015年在《大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达鉴定及SNAT2的拓扑结构的分析》文中研究指明Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白(Sodium-coupled Neutral Amino Acid Transporters,SNATs)属于SLC38基因家族。根据功能特性和调控模式,SLC38家族又分为System A和System N两个亚型。其中,SNAT2属于System A;SNAT3属于System N。SNAT2和SNAT3均由504个氨基酸组成,理论分子量约为56k Da。它们在转运氨基酸的同时会同向转运一个Na+,且转运过程对p H敏感。SNAT3由SLC38A3基因编码,主要定位于星形胶质细胞的细胞质膜上,通过反向转运一个H+的方式共转运氨基酸。SNAT2是System A中的第二个成员,广泛表达于哺乳动物组织中,其功能紊乱会导致多种神经退行性疾病。SNAT2与SNAT3在大脑的谷氨酸-谷氨酰胺循环、肝脏的糖异生、大脑和肝脏的氨解毒等生物通路中发挥着重要作用。鉴于SNAT2和SNAT3具有重要的生理功能,深入探索其结构和功能具有重要意义。为了方便检测大鼠谷氨酰胺转运蛋白SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到p BK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒。用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人胚胎肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位。结果表明,EGFP-SNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上。EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能。SNAT2被预测具有11个跨膜结构域,N端定位在细胞内,C端定位在细胞外。为了确定SNAT2中N、C端的膜定位、跨膜结构域的数量和各跨膜结构域的分布情况,本研究通过PCR扩增产生突变的方法,将HA标签插在了已预测的SNAT2中的亲水区,构建了17个带有HA标签序列(YPYDVPDYA)的SNAT2突变体。通过脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进HEK293T细胞中,并经间接免疫染色法和激光扫描共聚焦显微镜技术确定了插入的HA标签在细胞膜中的定位,从而初步确定了SNAT2分子的TMS数量。同时,本研究利用免疫荧光技术确定了SNAT2中N端与C端的膜定位。结果表明,SNAT2具有10个跨膜结构域,N、C端均定位于细胞膜外。这与之前已报道的结果有所不同。
郭航[7]2016年在《NDRG2通过调节谷氨酸转运发挥神经保护作用的研究》文中研究表明脑中风以其高致死率、高致残率严重危害人类健康,同时也为社会和家庭带来沉重的经济负担。近年来,众多治疗脑中风的潜在疗法和药物常常因疗效有限、副作用多等原因在临床转化过程中失败,寻找到脑中风治疗新的靶点刻不容缓。兴奋性神经毒性是脑中风最重要的病理基础,减轻兴奋性毒性损伤是挽救神经元的重要途径,但目前以神经元为靶标的治疗效果不尽人意。星形胶质细胞是神经元数量的5-10倍,以其对伤害刺激感受性强、耐受力好、调节度高等特性影响着神经元的转归[1],所以开拓思路,着眼于“神经-胶质单元”将为脑中风治疗开辟新的航道。NDRG2是由我校药立波教授所带领的团队于1999年首次发现与细胞分化、增殖以及应激相关的新基因,在中枢神经系统主要表达于星形胶质细胞,提示NDRG2极有可能参与星形胶质细胞调节的生理和病理过程。我们前期研究发现,NDRG2的RNA和蛋白表达在脑缺血再灌注后呈时间依赖性增加[2],在电针[3]和七氟醚[4]预处理诱导的脑缺血耐受过程中NDRG2也发挥了重要作用,说明NDRG2作为应激反应元件参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。该类实验是以探索预处理对神经保护作用为研究目的,在实验设计上要求NDRG2作为预处理对脑缺血再灌注损伤影响的一个观测指标,其表达含量和分布在时间和空间上的变化不仅受到缺血再灌注的影响,还极有可能率先受到预处理的影响发生改变,至于NDRG2本身对脑缺血再灌注损伤的作用和机制仍不明确,我们的研究将首次对此进行探索。基于以上研究结果,本课题将对NDRG2在脑缺血再灌注损伤中的作用进行探索,并对其作用机制进行深入研究。【目的】1、明确ndrg2对脑缺血再灌注损伤的影响;2、探索ndrg2影响兴奋性氨基酸——谷氨酸含量的方式和作用途径,以期明确ndrg2对脑缺血再灌注损伤神经保护作用的机制;3、进一步探索ndrg2与na+-k+-atpaseβ1相互作用的有效肽段,在体内、体外验证其对ndrg2神经保护作用的影响。【方法】1、构建2-6外显子ndrg2基因缺失的转基因鼠(ndrg2-/-),以其同窝的野生型小鼠(wt)做对照。ndrg2-/-小鼠右侧脑室注射ndrg2慢病毒(lv-ndrg2)和对照病毒(lv-ctrl)用于调节ndrg2在时间和空间上的表达。通过建立大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,mcao)模型模拟局灶性脑缺血再灌注损伤,缺血60min后恢复灌注24hr。通过longa神经功能学评分、ttc(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5-氯化叁苯基四氮唑)染色、缺血半暗带处neun(neuron-specificnuclearprotein)阳性神经元计数明确ndrg2对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。2、采用微透析定量检测脑内细胞外液神经递质的浓度,电生理技术分析谷氨酸能神经元sepsc的幅值和频率,westernblot分析nmdar1蛋白质的表达与分布,明确ndrg2对神经细胞间兴奋性电活动的影响;谷氨酸清除率的测定、westernblot方法用于分析ndrg2影响谷氨酸转运方式和相关蛋白的表达;质粒转染、免疫共沉淀方法在hek293细胞中检测ndrg2与na+-k+-atpaseβ1的相互作用;病毒转染、谷氨酸清除率的测定验证na+-k+-atpaseβ1对ndrg2调节的谷氨酸转运的作用。3、免疫共沉淀技术筛选na+-k+-atpaseβ1与ndrg2相互作用的关键肽段。在体外通过免疫共沉淀、westernblot、谷氨酸清除率证实该肽段对ndrg2与na+-k+-atpaseβ1相互作用及谷氨酸转运的影响;在体内通过对mcao60min再灌注24hr后神经功能学评分、ttc染色和免疫荧光染色检测有效肽段对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。【结果】1、ndrg2对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用ndrg2缺失可以使脑梗死容积和神经功能学评分增加(p<0.01),缺血半暗带区单位面积里neun阳性细胞数减少(p<0.01)。ndrg2-/-小鼠侧脑室注射ndrg2慢病毒恢复星形胶质细胞中NDRG2的表达,MCAO后脑梗死容积和神经功能学评分显着降低(p<0.05),缺血半暗带单位面积里NeuN阳性细胞数显着恢复(p<0.05)。2、NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1协同调节谷氨酸再摄取过程NDRG2缺失增加小鼠脑内细胞外液基础L-Glu浓度(p<0.01),增加谷氨酸能神经元sEPSC的幅度和频率(p<0.01),增加NMDAR1膜表达水平(p<0.01),降低星形胶质细胞对谷氨酸的清除能力(p<0.01),降低Na~+-K~+-ATPaseβ1、EAAT1和EAAT2蛋白质表达水平(p<0.01)。Ndrg2-/-小鼠侧脑室注射NDRG2慢病毒可以逆转上述现象(p<0.05)。在HEK293细胞中证实NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1蛋白质之间存在相互作用。Na~+-K~+-ATPaseβ1慢病毒可以显着提高Ndrg2-/-星形胶质细胞对Glu的清除能力(p<0.05)。3、Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)是NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用并影响谷氨酸转运进而影响NDRG2介导的神经保护作用的关键肽段Na~+-K~+-ATPaseβ1244-363是NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用的关键态肽段。Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)可以干扰内源性的NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1的相互作用,使二者解耦连,Na~+-K~+-ATPaseβ1半衰期显着缩短,星形胶质细胞对谷氨酸的清除能力显着降低(p<0.05),使MCAO60min,再灌注24 hr后小鼠脑内细胞外液中L-Glu浓度显着升高(p<0.01),脑缺血再灌注后脑梗死容积和神经功能学评分增加(p<0.01),缺血半暗带区单位面积NeuN阳性细胞数减少(p<0.01)。【结论】NDRG2可以通过Na~+-K~+-ATPase244-263肽段与Na~+-K~+-ATPaseβ1相互结合,稳定Na~+-K~+-ATPaseβ1的半衰期。NDRG2与Na~+-K~+-ATPaseβ1协同调节Na~+依赖的兴奋性谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的表达与功能,进而调节谷氨酸经星形胶质细胞再摄取的过程,维持突触间适当谷氨酸浓度和兴奋性电活动,从而发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。本研究丰富了NDRG2的生物学功能,为开发脑缺血的防治提供了新的靶点。
王月, 徐冰红, 刘虎, 姬朝光, 严汉池[8]2017年在《溶质转运蛋白超家族的功能及结构研究进展》文中研究说明溶质转运蛋白(solute carriers,SLC)超家族是人类细胞膜(含胞内膜)上最重要的膜转运蛋白家族之一,它参与了细胞间的物质运输、能量传递、营养代谢、信号传导等重要生理活动。SLC转运蛋白超家族包含52个亚家族,共有400多名成员。研究表明,人类基因突变所致SLC蛋白表达异常或功能缺陷与糖尿病、高血压、抑郁症等多种重大疾病密切相关,使得该家族蛋白的功能研究近年来备受关注。SLC转运家族蛋白叁维结构的解析有助于阐述其底物选择性结合与转运的精确分子机制,为研究该家族功能相关疾病的分子机理以及针对理性药物研发奠定了精细的叁维结构基础。本文对近年来溶质转运蛋白超家族的结构及功能研究进展进行了总结,试图对该家族的共性规律进行阐述。
赵宏丽[9]2012年在《精氨酸对细毛羊肠道蛋白质合成、氨基酸转运蛋白mRNA表达及肠道健康的影响》文中指出该论文目的在于研究日粮中添加不同水平的瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸对细毛羊断奶羔羊肠道蛋白质合成、氨基酸转运蛋白mRNA表达及肠道健康的影响,试验分为4部分：试验1应用体外产气法与消化法评定基础日粮的的消化率及瘤胃发酵参数该实验旨在探讨基础日粮的体外消化率及瘤胃产气发酵功能。选用3只体况良好,体重为40kg,年龄相近的健康绒山羊为试验瘤胃液提供动物。饲验动物在晨饲前采集瘤胃液进行体外两阶段消化实验和瘤胃产气实验。结果表明基础日粮瘤胃氨态氮浓度及PH值处于正常范围,干物质、粗蛋白和NDF的消化率以及产气量均较高。试验2在日粮添加不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸下,细毛羊断奶羔羊肠道粘膜蛋白成率变化规律的研究该实验旨在探讨不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸(NCG)对细毛羊肠粘膜蛋白合成率的影响。选用15只体况良好,体重为25±3.39kg的五月龄半同胞羯鄂尔多斯细毛羊断奶羔羊随机分成：基础日粮组(1组)、基础日粮+NCG-0.15g/d组(2组)、基础日粮+NCG-0.20g/d组(3组)、基础日粮+Arg-1.5g/d组(4组)、基础日粮+Arg-2.0g/d组(5组)。进行45天饲喂以后,试验羊空腹12小时后一次性大剂量灌注d5-苯丙氨酸90min后,采集十二指肠和空肠粘膜,检测小肠粘膜蛋白合成率(FSR)。结果表明：处理组的十二指肠与空肠粘膜的FSR显着高于对照组(P<0.05)。在各处理组中,第3组,第4组、第5组同对照组相比提高幅度较大,其中第5组显着高于其他处理组,但3、5组间差异不显着(P>0.05)。结果提示,添加不同水平的精氨酸及NCG对肠道粘膜蛋白合成率具有提高作用。试验3在日粮添加不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸下,细毛羊断奶羔羊肠道碱性氨基酸转运蛋白mRNA表达量变化规律的研究该实验旨在探讨不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸(NCG)对细毛羊断奶羔羊小肠内编码碱性氨基酸转运蛋白rBAT、b0.＋AT、4F2hc和CAT-1的溶质载体家族SLC3A1SLC7A9、SLC3A2、SLC7A1mRNA相对表达量的影响。实验动物饲养管理及分组情况同实验2。45天饲喂以后进行屠宰,取肠样来检测目的基因的相对表达量。结果表明,日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸提高了SLC3A1、 SLC7A9、SLC3A2和SLC7A1mRNA在十二指肠和空肠中的相对表达量。在空肠中处理组与对照组总体差异显着(P<0.05),但在十二指肠各组间差异不显着(P>0.05)。试验4在日粮添加不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸下,细毛羊断奶羔羊肠道健康变化的研究该研究旨在探讨不同水平瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸(NCG)对细毛羊断奶羔肠道健康的影响。实验动物饲养管理及分组情况同实验3,实验结果表明：关于免疫方面,结果表明：各处理组白细胞介素-2(IL-2)与分泌型免疫球蛋白(SIgA)的含量显着高于对照组(P<0.05),其中第4处理组提高幅度最大且与其他处理组相比差异显着(P<0.05)。结果提示：基础日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及NCG可以提高肠道免疫机能。关于抗氧化方面,结果表明：与对照组相比,基础日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及NCG可以降低黄嘌呤氧化酶(XOD)和丙二醛(MDA)的浓度,提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(T-SOD)的含量,其中3、4、5处理组与对照组相比差异显着(P<0.05)。结果提示：精氨酸对肠道抗氧化机能具有调节作用。关于肠道形态结构方面,结果表明：光镜观擦下各处理组的十二指肠绒毛高度与隐窝深度及其比例显着高于对照组(P<0.05),且各处理组间的绒毛高度与隐窝深度差异显着(P<0.05),但二者比值处理组间无明显差异(P>0.05)。其中第4处理组变化幅度最大。结果提示：基础日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸可以维护肠道的屏障功能,在一定程度上促进肠道发育。关于肠道酶活方面,结果表明：各处理组的碱性磷酸酶含量与对照组相比差异显着(P<0.05),且各处理组间差异显着(P<0.05)。结果提示：基础日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸可以促使绒毛发育和改善肠道消化吸收能力。关于一氧化氮与一氧化氮合酶方面,结果表明：与对照组相比,基础日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及NCG可以提高NO, iNOS及TNOS的含量,其中3、4、5处理组与对照组相比差异显着(P<0.05),且第4处理组与其他各处理相比差异显着。该实验结果提示：精氨酸对上述肠道免疫抗氧化机能的提高作用可能与NO合成量提高有直接关系。综合上述结果,我们发现日粮日粮中添加瘤胃保护性精氨酸及N-氨甲酰谷氨酸可以维护肠道健康。
参考文献：
[1]. 谷氨酸转运蛋白的结构与功能的研究[D]. 朱雅妮. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004
[2]. 大肠杆菌膜蛋白UraA和AdiC的结构和转运机制[D]. 鲁斐然. 清华大学. 2011
[3]. 鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的作用及其机制研究[D]. 刘辉. 第叁军医大学. 2007
[4]. 舒巴坦对全脑缺血大鼠海马CAI区GLT-1结合特性、谷氨酸摄取及谷氨酸浓度的影响[D]. 谷玮玮. 河北医科大学. 2018
[5]. 地衣芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶和聚γ-谷氨酸降解酶的研究[D]. 田光明. 华中农业大学. 2014
[6]. 大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达鉴定及SNAT2的拓扑结构的分析[D]. 李敏. 上海师范大学. 2015
[7]. NDRG2通过调节谷氨酸转运发挥神经保护作用的研究[D]. 郭航. 第四军医大学. 2016
[8]. 溶质转运蛋白超家族的功能及结构研究进展[J]. 王月, 徐冰红, 刘虎, 姬朝光, 严汉池. 现代生物医学进展. 2017
[9]. 精氨酸对细毛羊肠道蛋白质合成、氨基酸转运蛋白mRNA表达及肠道健康的影响[D]. 赵宏丽. 内蒙古农业大学. 2012
标签：生物学论文; 谷氨酸论文; 舒巴坦论文; 鱼藤酮论文; 星形胶质细胞论文; 脑缺血论文; 谷氨酸受体论文; 基因合成论文; 神经元细胞论文; 基因结构论文;