导读:本文包含了视网膜下腔论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:外周血单个核细胞,成人干细胞,视网膜下腔移植,多能性
视网膜下腔论文文献综述
冼碧琨[1]（2016）在《预诱导培养的成人外周血单个核细胞在视网膜下腔移植后存活和功能修复的研究》一文中研究指出第一章成人外周血单个核细胞的分离及体外预诱导培养目的:从成人外周血中分离出单个核细胞,并进行预诱导培养,从形态和基因水平观察其变化。方法:应用密度梯度离心法将外周血单个核细胞从健康成人的外周血中分离出来,然后与新生大鼠的视网膜组织进行共培养4天,倒置显微镜观察其形态变化,实时定量PCR检测预诱导前后细胞RNA表达的变化。预诱导培养结束后将细胞用于小鼠的视网膜下腔移植。结果:新鲜分离的成人外周血单个核细胞圆形透亮,在神经干细胞培养液中散在分布,悬浮生长。随后叁天,部分细胞依然是圆形悬浮生长;而部分细胞逐渐发生形态变化,有些细胞贴壁生长,伸出一到叁个短小的突起;还有部分细胞聚集呈团状半贴壁生长。实时定量PCR结果显示,预诱导培养后Nestin、βⅢ-tubulin、Rhodopsin、MAP2、GFAP、Synapsin、CD14、CD44、CD45、CD11b、CD19的RNA表达量提高,而CD16、CD3、CD34、Vimentin的表达量下降,其中MAP2、Rhodopsin、CD19和Vimentin的变化有统计学差异。结论:成人外周血单个核细胞在预诱导培养后有向神经细胞及光感受器细胞分化的趋势。第二章:预诱导培养后的成人外周血单个核细胞移植到模式小鼠视网膜下腔后的存活及功能修复情况目的:观察预诱导培养的成人外周血单个核细胞在视网膜下腔移植后的存活及功能修复的情况。方法:将预诱导培养后的成人外周血单个核细胞经视网膜下腔注射移植到12月龄的rd1和rds小鼠右眼中。6个月后,取rds小鼠的实验眼做冰冻切片及免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察移植细胞的存活和在视网膜各层的分布及表达各种标志物的情况。细胞移植后的rd1小鼠,分别于1个月、3个月及5个月的时候做双眼的全视野视网膜电图检测,然后取实验眼的视网膜组织做PCR,检测移植细胞的存活情况。结果:移植6个月后rds小鼠治疗眼的冰冻切片显示,成人外周血单个核细胞可分布到内核层和节细胞层,而且部分细胞表达神经干细胞标志物Nestin,神经祖细胞标志物Vimentin、βⅢ-tubulin,神经细胞标志物MAP2,及光感受器细胞标志物Rhodopsin,但有部分移植细胞并没有表达相关的蛋白。PCR结果显示,移植后1、3、5个月,人的细胞色素b基因仍在小鼠的实验眼中有表达,说明移植细胞的存在。全视野视网膜电图结果显示,移植后1个月,所有接受移植的rd1小鼠的双眼都检测不到有对光反应,与未接受移植的对照rd1小鼠表现相同;移植3个月后,所有接受移植的小鼠的双眼都有明显的对光反应,且两眼的表现没有差异;移植5个月后,只有部分治疗小鼠的实验眼保留有对光反应,而所有的对照眼及部分实验眼已失去对光反应。结论:在进行视网膜下腔移植5~6个月后,成人的外周血单个核细胞能在小鼠的视网膜中存活,并且部分细胞仍有表达神经细胞相关标志物及光感受器细胞标志物。在功能方面,成人外周血单个核细胞能在移植后3~5个月发挥其修复作用,但在5个月左右,该作用不能继续维持。(本文来源于《中山大学》期刊2016-06-30）
赵立宇[2]（2016）在《视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对视网膜色素上皮影响的实验研究》一文中研究指出研究背景许多视网膜疾病,如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)等都会引起视网膜细胞的死亡,从而导致不可逆的视力丧失。目前对于此类疾病,临床上仍无有效的治疗方法,可采用的方法有视网膜光凝、冷凝、手术、抗炎治疗、神经营养支持等,但其临床疗效并不显着,难以恢复患者的受损视力。近年来,随着国内外研究者对干细胞的不断深入研究,视网膜细胞的再生和功能重建已成为炙手可热的话题,干细胞移植治疗为视网膜疾病患者带来了新的希望,也引起广大眼科临床工作者的关注。干细胞是指生物个体生长发育的原始细胞,同时具有自我复制和多向分化潜能的细胞,目前用于科研研究的主要是胚胎干细胞。胚胎干细胞(embryon ic stem cell, ESCs)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境,ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。目前用于治疗视网膜疾病的眼源性干细胞主要包括源于视网膜的干细胞和前体细胞、Mul ler细胞、虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium, IPE)和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)。视网膜色素上皮是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则。细胞呈多角形,细胞分为叁部分,即顶部、体部和基底部。RPE细胞对视网膜的营养及维持光感受器细胞的正常功能起到重要作用,如传递光感受器新陈代谢所需的物质、参与维生素A代谢、构成视网膜外屏障、参与眼球的发育、屈光不正的发生发展及生长因子的产生等。RPE细胞在许多视网膜疾病如ROP、AMD、DR的发生发展中起到重要作用,目前临床上用于修复此类视网膜损伤疾病主要有手术、视网膜光凝、抗VEGF药物等方法,但临床疗效不佳,难以恢复患者的受损视力,RPE细胞移植给此类视网膜损伤疾病的治疗带来的新的方向。我们对小鼠RPE细胞分离、培养及视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞进行实验研究,同时讨论胚胎干细胞及几种主要的眼源性干细胞在眼科领域的应用进展展开讨论,现将结果报告如下。目的观察视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响。方法1.体外分离、培养及冻存小鼠视网膜色素上皮细胞：取C57BL/6小鼠10只,脊髓脱臼法处死小鼠,取出眼球,清洗、去除眼前段组织后将眼杯泡在清洗液,用镊子轻轻挑起膨胀的视网膜神经上皮层,用显微剪在视盘表面去除视网膜神经上皮层,清洗后使用胰蛋白酶溶液消化,消化完成后用微量注射器轻轻吹打眼杯内表面,收集含黑色素颗粒的培养液,常规离心后接种于培养瓶中,放入培养箱中培养。完成取材后每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液,细胞贴壁后隔天换液,当细胞融合度达约90%时,记录所用时间,并按1：4的比例传代。传代后依旧每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液。取第1、4代小鼠RPE细胞,消化后细胞计数,接种于24孔板,置于培养箱中培养,每日取3孔细胞进行计数,取平均值绘制生长曲线。将第1代的小鼠RPE细胞接种于24孔培养板中,3d后取出洗涤,冰丙醇固定,自然干燥后密闭保存,细胞爬片经漂洗后用过氧化物酶以消除内源性过氧化物酶活性,再次洗涤,然后加入鼠抗人RPE65蛋白一抗,孵育、漂洗后加入大鼠抗山羊以及山羊抗兔二抗,孵育、漂洗,二氨基联苯胺显色,置于显微镜下观察,若胞浆呈现棕黄色则为阳性,否则为阴性。空白对照组用PBS液代替一抗作阴性对照。第4代小鼠RPE细胞生长至细胞融合度达约90%时,即可行细胞冻存,配制20%胎牛血清加8%二甲基亚砜的冻存液,将细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,同时计数,常规离心、重悬沉淀后移入冻存管,放入泡沫盒内,直接放入-80℃冰箱冻存以备后续实验行细胞复苏后使用。2.小鼠视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞：从.80℃冰箱中取出冰冻的小鼠RPE细胞冻存管,解冻后将细胞转移至含RPE细胞培养液的离心管中混匀,常规离心、吸弃上清液后重悬细胞沉淀,转移悬浮液至培养瓶中,补加小鼠RPE细胞培养液至6 ml。复苏后小鼠视网膜色素上皮细胞状态不稳定,需传代2次后再行视网膜下腔移植,当细胞融合度约达90%时传代,洗涤、消化后显微镜下观察到细胞变圆,有细胞开始脱离瓶壁时,停止消化。离心、重悬沉淀后按照1：8的比例传代至新的培养瓶中,轻轻摇匀后移入培养箱中。小鼠RPE细胞传代2次后显微镜下观察,当细胞融合度达90%以上时,用胰蛋白酶消化,离心重悬细胞沉淀后加入培养液混匀,制备成约1×106个/ml浓度的小鼠RPE细胞悬浮移植液。将30只7日龄C57BL/6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型组及OIR模型细胞移植组,每组10只。OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型：将小鼠与母鼠共同置于氧浓度(75±2)%的氧箱内,箱内温度(23±2)℃,每天日光照射12h,饲养5d后转移至正常环境中饲养5 d。正常组小鼠与母鼠共同置于密闭箱内,温度(23±2)℃,每天日光照射12 h,饲养5 d。对OIR模型细胞移植组小鼠行外路视网膜下腔移植手术。腹腔麻醉小鼠,切开眼球上方结膜少许,暴露巩膜,用显微铲针刺穿前房放出少许房水,在角膜缘后2mm处用显微注射器向着眼球后方稍平行巩膜斜向刺入球壁,注入细胞液,同样术式处理OIR模型组小鼠,注射小鼠RPE细胞培养液,术毕涂红霉素眼膏以防止感染。采用荧光显微镜观察各组小鼠RPE层的变化。取各组小鼠行视网膜冰冻切片,固定、脱水、包埋,切片后置于湿盒内,加入1：50稀释的荧光标记RPE65,冲洗后,加入辣根过氧化物酶二抗,孵育、冲洗、染核、漂洗后转移至载玻片上,避光自然晾干,盖上盖玻片荧光显微镜下观察并拍照。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量。采用RT-PCR检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量。结果1.初分离的原代小鼠RPE细胞镜下可见胞体呈圆形,梭形,不规则形,内含丰富的黑色素颗粒,未见细胞核,12h后大部分细胞贴壁,贴壁细胞可见清晰的细胞核,4d后细胞融合成单层生长。传代后第1代细胞活力较强,2-3d后细胞融合,形态多呈梭形及不规则形,黑色素颗粒较多,但对比原代细胞明显变淡,第4代细胞,黑色素颗粒较少,细胞渐趋透明。生长曲线结果表明第1、4代小鼠视网膜色素上皮细胞均在第3d进入细胞对数生长期,4-5d生长显着,随后进入稳定期,其中第1代小鼠视网膜色素上皮细胞生长速度稍快于第4代。第1代小鼠视网膜色素上皮细胞经免疫细胞化学检测RPE65蛋白显示小鼠视网膜色素上皮细胞呈阳性反应,细胞胞浆内呈棕黄色,空白对照组呈阴性。2.荧光显微镜观察发现,正常组小鼠RPE层呈结构整齐的单层排列,OIR模型组小鼠RPE层连续性中断,排列紊乱,部分位置缺失RPE细胞,OIR模型细胞移植组小鼠RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。Western blot检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65蛋白相对表达量分别为123.750±6.752、100.000±15.492、124.000±5.292；Bestrophin蛋白相对表达量分别为95.250±15.414、52.750±15.392、109.000±20.833；ZO.1蛋白相对表达量分别为93.750±6.946、93.500±6.807、83.500±8.583。统计学分析结果示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验p>0.05,F=7.272、2.438、11.358,多组间差异RPE65蛋白、Bestrophin蛋白有统计学意义,p<0.05,而Zo-1蛋白无统计学差异。组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928±0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；ZO-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p>0.05,F=28.155、20.769、11.066,多组间差异有统计学意义,p<0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1蛋白相对表达量,各组间均无统计学差异,p>0.05。结果显示RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量正常组、OIR模型细胞移植组均比OIR模型组增高,而OIR模型组细胞移植组与正常组无统计学差别；ZO.1蛋白相对表达量各组间均无统计学差异。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928-0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；Zo-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p>0.05,F=28.155、20.769、II.066,多组间差异有统计学意义,p<0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。结论1.改良酶消化法可以成功体外分离、培养及冻存小鼠RPE细胞,细胞纯度高、贴壁率高、细胞活力较强,为后续实验提供了细胞来源。2.视网膜下腔移植RPE细胞可促进小鼠视网膜色素上皮层增殖,RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。通过对RPE65、Zo-1、Bestrophin叁种蛋白和基因的检测发现,视网膜下腔移植RPE细胞可以增强调控维生素A的反式.顺式异构化能力及细胞吞噬能力,移植细胞的生物学功能得以发挥,而移植细胞与原宿主细胞的紧密连接的形成尚不充分。(本文来源于《南方医科大学》期刊2016-05-25）
戚艳[3]（2015）在《小鼠经角膜视网膜下腔注射的方法学研究》一文中研究指出目的:观察小鼠经角膜视网膜下腔注射对视网膜形态和功能的影响.方法:2月龄SPF级C57 BL/6J小鼠充分扩瞳后,在眼科专用手术显微镜下用301/2G一次性注射针头在角巩膜缘内侧穿刺小鼠右眼角膜,用带有33G平针头的微量进样器沿穿刺口进入并绕过晶状体后到达玻璃体,然后逐渐进针至视网膜下腔隙,缓慢推注1μl质量分数0.1%荧光素钠生理盐水注射液.根据注射(本文来源于《2015年浙江省眼科学术年会暨国际眼科临床前沿技术论坛论文汇编》期刊2015-11-26）
宋晓晴[4]（2014）在《视网膜下腔移植骨髓间充质干细胞对光损伤视网膜保护作用的研究》一文中研究指出目的：研究视网膜光损伤动物模型中，视网膜组织结构的变化以及视网膜细胞凋亡的情况；移植GFP-BMSCs至视网膜光损伤大鼠的视网膜下腔，观察移植的细胞对视网膜的作用。方法：1.视网膜光损伤大鼠造模：长时间循环光照SD大鼠制成视网膜光损伤模型，于光照后第3d、7d、10d、14d摘除眼球，行HE染色观察视网膜组织结构的变化及TUNEL检测视网膜细胞的凋亡情况。2. GFP-BMSCs视网膜下腔移植：将GFP-BMSCs移植入视网膜光损伤大鼠的视网膜下腔，移植7d后，采用HE染色、TUNEL检测、免疫荧光、realtime-PCR观察正常对照组、光损伤造模组、BMSCs注射组、DMEM注射组的视网膜外核层厚度、视网膜细胞凋亡数以及神经营养因子（bFGF、BDNF）的表达情况；采用免疫荧光、realtime-PCR观察BMSCs注射组移植后的第1d、3d、7d、14d、21d，移植细胞迁移现象以及bFGF、BDNF的表达情况。结果：1.HE染色观察到视网膜外核层的厚度随着光照时间的增加而变薄；TUNEL显示视网膜细胞凋亡数随着光照时间的延长而增加。2. GFP-BMSCs移植后可阻止视网膜外核层厚度变薄（P<0.05），还使视网膜细胞的凋亡数减少（P<0.05）；免疫荧光显示四组表达神经营养因子的定位不尽相同，免疫荧光、RT-PCR检测分别显示移植后bFGF、BDNF的表达量及其mRNA的表达量均增多（P<0.05）。免疫荧光、RT-PCR检测显示移植后的21d内bFGF、BDNF及其mRNA的表达量均呈现先增高后降低的表现，但表达高峰的时间点不同；视网膜下腔移植的GFP-BMSCs可以向视网膜内层组织迁移。结论：视网膜下腔移植GFP-BMSCs具有对光损伤视网膜的神经保护作用，其机制可能是移植后的BMSCs分泌神经营养因子，以及促进视网膜细胞分泌神经营养因子，从而促进光损伤视网膜的修复。(本文来源于《福建医科大学》期刊2014-06-01）
陶靖,葛坚[5]（2009）在《胚胎干细胞源性视网膜前体细胞在rd鼠视网膜下腔移植后的分化》一文中研究指出目的研究绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞(green fluorescent protein-embryonic stem cells,GFP-ESC)源性视网膜前体细胞在rd小鼠视网膜下腔移植后的存活分化情况。方法将GFP-ESC源性视网膜前体细胞移植到伴有视网膜感光细胞变性和继发性视网膜神经节细胞变性的rd小鼠视网膜下腔,移植后1周、4周、8周取材行免疫荧光细胞化学检测,观察移植细胞存活、分化情况。对移植细胞进行核型分析,并接种裸鼠眼内观察是否成瘤,评价其安全性。结果GFP-ESC源性视网膜前体细胞移植眼内可存活、整合到宿主变性视网膜层间。1周时GFP阳性细胞移行于外层视网膜并呈视杆细胞标志抗原rhodop-sin阳性;4周时整合于内层视网膜,共表达成熟神经元标志抗原神经丝蛋白-200、微管相关蛋白-2,突触标志抗原synaptophysin检测阳性;8周时移至邻近玻璃体腔形成节细胞样结构,表达节细胞标志抗原Thy1.1;移植细胞维持正常二倍体核型,术后8周未见排斥反应及瘤性增殖。结论GFP-ESC源性视网膜前体细胞在变性视网膜中可存活、整合,并有优先向变性的感光细胞及神经节细胞类型分化的倾向,有望为青光眼等视神经视网膜病变的细胞移植治疗提供安全有效的种子细胞。(本文来源于《眼科新进展》期刊2009年07期）
董晓飞[6]（2009）在《视网膜下腔移植具有神经干细胞特性的Müller细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用》一文中研究指出目的以RCS大鼠为模型,研究经诱导产生神经干细胞特性的Muller细胞视网膜下腔移植对光感受器变性的保护作用。方法向6周龄VC大鼠玻璃体腔内注射神经毒素混合液(包含NMDA、Kainate、FGF2和insulin)刺激视网膜M(u|¨)ller细胞。1周后,取材分离M(u|¨)ller细胞体外原代培养纯化。将细胞标记后,以每眼1×10~5个细胞的密度移植到6周龄RCS大鼠右眼视网膜下腔,左眼分组注射正常M(u|¨)ller细胞和PBS作为同型对照以及阴性对照。术后分别于第1、3、5、7周,行视网膜铺片、病理切片以及视觉电生理检查。结果培养的M(u|¨)ller细胞纯度可达96%以上,其中表达神经干细胞标志物的细胞占总细胞量的53%以上。光镜病理切片观察显示,在相同时间点,移植眼保留的光感受器细胞数量明显较同型对照眼多,同型对照移植眼保留的光感受器细胞数量明显较阴性对照眼多。视网膜电图(ERG)检查结果同病理结果相符。结论视网膜下腔移植经诱导产生神经干细胞特性的M(u|¨)ller细胞可以有效延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性性疾病提供了新的途径。(本文来源于《第二军医大学》期刊2009-05-01）
康前雁,刘勇,田玉梅,祁存芳,张建水[7]（2007）在《人视网膜前体细胞移檀于缺血损伤大鼠视网膜下腔的存活与分化》一文中研究指出目的：研究人视网膜前体细胞在视网膜缺血损伤大鼠视网膜下腔的存活与分化,探讨视网膜前体细胞作为种子细胞行视网膜移植的可行性。方法：体重200—250g 健康雄性 SD 大鼠,以左眼为实验服,前房生理盐水灌注,使眼压相当于(本文来源于《中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编》期刊2007-08-01）
田洁,李根林[8]（2006）在《视网膜下腔免疫赦免研究进展》一文中研究指出视网膜下腔是免疫赦免部位,能诱导免疫偏离,产生免疫耐受。血-视网膜屏障的隔离作用、TGF-β和IFN等免疫因子的调节作用;CD95L、可溶性因子、Galectin-Ⅰ和TRAIL等所介导的RPE对T淋巴细胞的调节作用均参与了视网膜下腔的免疫赦免机制。RPE、小胶质细胞以及视网膜微血管内皮细胞等相关APC均参与了移植物的免疫排斥反应过程。视网膜移植免疫排斥反应过程中,免疫抑制剂的使用和免疫耐受状态的产生可以有效降低术后免疫排斥反应的发生。(本文来源于《国际眼科纵览》期刊2006年04期）
李世迎,阴正勤,陈少军,曾玉晓,陈丽峰[9]（2006）在《人胚胎视网膜移植到光诱导视网膜变性猪视网膜下腔后的形态与功能整合研究》一文中研究指出目的:将人胚胎视网膜神经上皮层和色素上皮层联合移植到光诱导视网膜变性猪的视网膜下腔,观察移植物和宿主的活体及离体形态学变化、宿主视功能的改变。方法:取12— 30周流产胎儿为供体,用准分子激光切削脉络膜,制备视网膜神经上皮层和色素上皮层联合移植片。对14只被白色荧光灯照射6月后的光变性猪(28眼)和3只正常猪(5 眼)共33眼行玻璃体切割术。光变性猪移植手术25眼,伪手术3眼;正常猪移植手术4眼,伪手术1眼。术后1、2、(本文来源于《第叁届全球华人眼科学术大会暨中华医学会第十一届全国眼科学术大会论文汇编》期刊2006-08-01）
张良,唐仕波,黄冰,陈系古,马静[10]（2006）在《胚胎干细胞C3B鼠视网膜下腔移植分化研究》一文中研究指出目的:探讨胚胎干细胞在具有正常视网膜结构的C3B鼠视网膜下腔中的诱导分化情况。方法:胚胎干细胞传1代后进行拟胚体培养。拟胚体消化成单细胞后联合视黄酸注入C3B鼠视网膜下腔,注射后1周、3周、2月处死小鼠取材进行病理切片、电镜检查和免疫组化检测。结果:1周时,可见到注射部位视网膜层水肿增厚。3周和2个月时,3只移植眼内出现畸胎瘤,占所有移植眼的25%,其余眼球注射部位仅见瘢痕组织或眼球萎缩。电镜发现增殖的细胞核异型性明显,具肿瘤细胞特征。免疫组化显示:畸胎瘤部分区域MAP-2强阳性反应;可见团状或集落状细胞GFAP强阳性反应;个别细胞Nestin阳性反应。结论:胚胎干细胞移植入具有正常视网膜结构的C3B鼠视网膜下腔,未能出现ESC向视网膜组织分化或嵌入视网膜组织,相当部分的鼠眼出现了畸胎瘤,其临床安全性和致瘤性是非常值得关注的问题。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2006年07期）
视网膜下腔论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景许多视网膜疾病,如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)等都会引起视网膜细胞的死亡,从而导致不可逆的视力丧失。目前对于此类疾病,临床上仍无有效的治疗方法,可采用的方法有视网膜光凝、冷凝、手术、抗炎治疗、神经营养支持等,但其临床疗效并不显着,难以恢复患者的受损视力。近年来,随着国内外研究者对干细胞的不断深入研究,视网膜细胞的再生和功能重建已成为炙手可热的话题,干细胞移植治疗为视网膜疾病患者带来了新的希望,也引起广大眼科临床工作者的关注。干细胞是指生物个体生长发育的原始细胞,同时具有自我复制和多向分化潜能的细胞,目前用于科研研究的主要是胚胎干细胞。胚胎干细胞(embryon ic stem cell, ESCs)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境,ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。目前用于治疗视网膜疾病的眼源性干细胞主要包括源于视网膜的干细胞和前体细胞、Mul ler细胞、虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium, IPE)和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)。视网膜色素上皮是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则。细胞呈多角形,细胞分为叁部分,即顶部、体部和基底部。RPE细胞对视网膜的营养及维持光感受器细胞的正常功能起到重要作用,如传递光感受器新陈代谢所需的物质、参与维生素A代谢、构成视网膜外屏障、参与眼球的发育、屈光不正的发生发展及生长因子的产生等。RPE细胞在许多视网膜疾病如ROP、AMD、DR的发生发展中起到重要作用,目前临床上用于修复此类视网膜损伤疾病主要有手术、视网膜光凝、抗VEGF药物等方法,但临床疗效不佳,难以恢复患者的受损视力,RPE细胞移植给此类视网膜损伤疾病的治疗带来的新的方向。我们对小鼠RPE细胞分离、培养及视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞进行实验研究,同时讨论胚胎干细胞及几种主要的眼源性干细胞在眼科领域的应用进展展开讨论,现将结果报告如下。目的观察视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响。方法1.体外分离、培养及冻存小鼠视网膜色素上皮细胞：取C57BL/6小鼠10只,脊髓脱臼法处死小鼠,取出眼球,清洗、去除眼前段组织后将眼杯泡在清洗液,用镊子轻轻挑起膨胀的视网膜神经上皮层,用显微剪在视盘表面去除视网膜神经上皮层,清洗后使用胰蛋白酶溶液消化,消化完成后用微量注射器轻轻吹打眼杯内表面,收集含黑色素颗粒的培养液,常规离心后接种于培养瓶中,放入培养箱中培养。完成取材后每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液,细胞贴壁后隔天换液,当细胞融合度达约90%时,记录所用时间,并按1：4的比例传代。传代后依旧每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液。取第1、4代小鼠RPE细胞,消化后细胞计数,接种于24孔板,置于培养箱中培养,每日取3孔细胞进行计数,取平均值绘制生长曲线。将第1代的小鼠RPE细胞接种于24孔培养板中,3d后取出洗涤,冰丙醇固定,自然干燥后密闭保存,细胞爬片经漂洗后用过氧化物酶以消除内源性过氧化物酶活性,再次洗涤,然后加入鼠抗人RPE65蛋白一抗,孵育、漂洗后加入大鼠抗山羊以及山羊抗兔二抗,孵育、漂洗,二氨基联苯胺显色,置于显微镜下观察,若胞浆呈现棕黄色则为阳性,否则为阴性。空白对照组用PBS液代替一抗作阴性对照。第4代小鼠RPE细胞生长至细胞融合度达约90%时,即可行细胞冻存,配制20%胎牛血清加8%二甲基亚砜的冻存液,将细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,同时计数,常规离心、重悬沉淀后移入冻存管,放入泡沫盒内,直接放入-80℃冰箱冻存以备后续实验行细胞复苏后使用。2.小鼠视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞：从.80℃冰箱中取出冰冻的小鼠RPE细胞冻存管,解冻后将细胞转移至含RPE细胞培养液的离心管中混匀,常规离心、吸弃上清液后重悬细胞沉淀,转移悬浮液至培养瓶中,补加小鼠RPE细胞培养液至6 ml。复苏后小鼠视网膜色素上皮细胞状态不稳定,需传代2次后再行视网膜下腔移植,当细胞融合度约达90%时传代,洗涤、消化后显微镜下观察到细胞变圆,有细胞开始脱离瓶壁时,停止消化。离心、重悬沉淀后按照1：8的比例传代至新的培养瓶中,轻轻摇匀后移入培养箱中。小鼠RPE细胞传代2次后显微镜下观察,当细胞融合度达90%以上时,用胰蛋白酶消化,离心重悬细胞沉淀后加入培养液混匀,制备成约1×106个/ml浓度的小鼠RPE细胞悬浮移植液。将30只7日龄C57BL/6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型组及OIR模型细胞移植组,每组10只。OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型：将小鼠与母鼠共同置于氧浓度(75±2)%的氧箱内,箱内温度(23±2)℃,每天日光照射12h,饲养5d后转移至正常环境中饲养5 d。正常组小鼠与母鼠共同置于密闭箱内,温度(23±2)℃,每天日光照射12 h,饲养5 d。对OIR模型细胞移植组小鼠行外路视网膜下腔移植手术。腹腔麻醉小鼠,切开眼球上方结膜少许,暴露巩膜,用显微铲针刺穿前房放出少许房水,在角膜缘后2mm处用显微注射器向着眼球后方稍平行巩膜斜向刺入球壁,注入细胞液,同样术式处理OIR模型组小鼠,注射小鼠RPE细胞培养液,术毕涂红霉素眼膏以防止感染。采用荧光显微镜观察各组小鼠RPE层的变化。取各组小鼠行视网膜冰冻切片,固定、脱水、包埋,切片后置于湿盒内,加入1：50稀释的荧光标记RPE65,冲洗后,加入辣根过氧化物酶二抗,孵育、冲洗、染核、漂洗后转移至载玻片上,避光自然晾干,盖上盖玻片荧光显微镜下观察并拍照。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量。采用RT-PCR检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量。结果1.初分离的原代小鼠RPE细胞镜下可见胞体呈圆形,梭形,不规则形,内含丰富的黑色素颗粒,未见细胞核,12h后大部分细胞贴壁,贴壁细胞可见清晰的细胞核,4d后细胞融合成单层生长。传代后第1代细胞活力较强,2-3d后细胞融合,形态多呈梭形及不规则形,黑色素颗粒较多,但对比原代细胞明显变淡,第4代细胞,黑色素颗粒较少,细胞渐趋透明。生长曲线结果表明第1、4代小鼠视网膜色素上皮细胞均在第3d进入细胞对数生长期,4-5d生长显着,随后进入稳定期,其中第1代小鼠视网膜色素上皮细胞生长速度稍快于第4代。第1代小鼠视网膜色素上皮细胞经免疫细胞化学检测RPE65蛋白显示小鼠视网膜色素上皮细胞呈阳性反应,细胞胞浆内呈棕黄色,空白对照组呈阴性。2.荧光显微镜观察发现,正常组小鼠RPE层呈结构整齐的单层排列,OIR模型组小鼠RPE层连续性中断,排列紊乱,部分位置缺失RPE细胞,OIR模型细胞移植组小鼠RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。Western blot检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65蛋白相对表达量分别为123.750±6.752、100.000±15.492、124.000±5.292；Bestrophin蛋白相对表达量分别为95.250±15.414、52.750±15.392、109.000±20.833；ZO.1蛋白相对表达量分别为93.750±6.946、93.500±6.807、83.500±8.583。统计学分析结果示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验p>0.05,F=7.272、2.438、11.358,多组间差异RPE65蛋白、Bestrophin蛋白有统计学意义,p<0.05,而Zo-1蛋白无统计学差异。组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928±0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；ZO-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p>0.05,F=28.155、20.769、11.066,多组间差异有统计学意义,p<0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1蛋白相对表达量,各组间均无统计学差异,p>0.05。结果显示RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量正常组、OIR模型细胞移植组均比OIR模型组增高,而OIR模型组细胞移植组与正常组无统计学差别；ZO.1蛋白相对表达量各组间均无统计学差异。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928-0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；Zo-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p>0.05,F=28.155、20.769、II.066,多组间差异有统计学意义,p<0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。Bestrophin mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。ZO-1 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p<0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p>0.05。结论1.改良酶消化法可以成功体外分离、培养及冻存小鼠RPE细胞,细胞纯度高、贴壁率高、细胞活力较强,为后续实验提供了细胞来源。2.视网膜下腔移植RPE细胞可促进小鼠视网膜色素上皮层增殖,RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。通过对RPE65、Zo-1、Bestrophin叁种蛋白和基因的检测发现,视网膜下腔移植RPE细胞可以增强调控维生素A的反式.顺式异构化能力及细胞吞噬能力,移植细胞的生物学功能得以发挥,而移植细胞与原宿主细胞的紧密连接的形成尚不充分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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